[发明专利]电穿孔装置和细胞转染方法

说明书

提供了使用具有电穿孔室的电穿孔设备转染细胞，例如哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞的系统和方法，所述电穿孔室包括第一电极、第二电极和在所述电穿孔室中限定的路径。所述电穿孔设备包括允许细胞和货物通过进入所述电穿孔室的第一输入以及允许来自所述电穿孔室的经电穿孔的细胞通过的第一输出。

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§365(c)要求于2019年7月9日提交的国际专利申请号PCT/US 2019/041055的优先权，其全部内容通过引用特此并入。

技术领域

本发明的领域涉及转染系统和方法，尤其涉及电穿孔系统和方法。

背景技术

背景描述包括可用于理解本文中呈现的方法和技术的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与本文呈现的主题相关，也不承认具体或隐含地引用的任何出版物是现有技术。

转染可用于将核酸引入细胞以产生基因修饰的细胞。存在用于转染细胞的多种物理、化学和病毒方法，包括光电穿孔、利用磷酸钙的基于聚合物的方法、显微注射、电穿孔、病毒转导和脂质介导的方法(例如，使用脂质体-DNA复合物)。

电穿孔涉及在相对短的持续时间内向细胞施加受控的直流(DC)电脉冲。电脉冲被认为引起跨膜电位，所述跨膜电位引起细胞膜的有序结构的可逆破坏，从而导致在膜中形成孔。然后，目的分子可以通过孔进入细胞，直到孔关闭，这典型地在几毫秒到几秒钟内。孔的形成可以通过调节各种参数来控制，尤其是间隙宽度(例如，平行电极板之间的距离)、电脉冲波形、电场强度、温度和电脉冲长度。

电穿孔通常以实验室规模使用(例如，使用容量为约0.5mL的小比色杯)，但是由于缺乏效率和成本高，这种基于实验室的技术不适合大规模临床级生产。也经常使用其他转染方法，例如使用Lipofectamine 2000^TM的基于脂质的技术，但其由于成本高而具有类似的缺点。另外，基于脂质的方法不适用于某些具有临床意义的细胞类型，例如NK细胞，例如haNK。已使用mRNA和电穿孔对NK细胞进行了转染，例如，遗传操纵原代NK细胞以表达嵌合抗原受体(CAR-参见Leuk Res.[白血病研究](2009)33：1255-9)或表达用于自分泌型生长刺激的细胞因子(Cytotherapy[细胞疗法](2008)10：265-74)。虽然存在用于大规模转染(例如，反应体积大于1mL)的商业产品(例如Maxcyte)，但这些产品也很昂贵和/或缺乏高通量能力。类似地，这些商业产品对于转染NK细胞不是最佳的，通常导致产率低和/或细胞活率低的问题。典型的电穿孔速率可产生2％-5％的DNA转染效率，其中细胞活率为约10％-20％。

使用常规技术，如图1A所示，可以使用两个平行板电极进行电穿孔。在这种构造中，细胞典型地在两个平行板之间流动。但是，电场是不均匀的，室的中部的细胞(如(a)所示)经历更均匀的电场，而电极附近的细胞(如(b)所示)则经历不均匀的电场并且尤其经历电极边界处存在的电场尖峰。其他技术利用微网电极的平行板，如图1B所示(Selmeczi，D.等人，″Efficient large volume electroporation of dendritic cells throughmicrometer scale manipulation of flow in a disposable polymer chip[通过微米级处理一次性聚合物芯片中的流动，有效地进行树突状细胞的大量电穿孔]，″BiomedMicrodevices[生物医学微装置]，13：383-392(2011))，其中细胞穿过上微网电极和下微网电极。尽管与通过两个平行电极板之间相比，此技术提供更均匀的电场(如室(a)中部和室(b)边界附近的细胞的相似轨迹所示)，但上微网电极和下微网电极之间的室宽度或距离受到限制，导致转染效率低。图1A和1B中所示的构造利用了约1-1.3kV/em的电场强度(例如，对于平行板为200V/2mm，对于平行微网电极为40V/400um)。