[发明专利]对花青染料存在下的扩增抑制具有抗性的突变型Taq聚合酶

说明书

本发明包括一种突变型Taq聚合酶或其生物活性片段，该突变型Taq聚合酶或其生物活性片段可以与野生型Taq聚合酶相比显著地延伸和扩增目标序列，其中延伸混合物包括不对称的花青染料，包括SYBR Green I。所述突变型Taq聚合酶或其生物活性片段具有表I所示的区别于野生型的一种或多种取代。

序列表

本申请包含以ASCII格式电子提交的序列表，在此通过全文引用并入本文。所述ASCII副本创建于2020年5月5日，名为Abclonal-SYBR_SL.txt，大小为2,614,903字节。

背景技术

在DNA扩增的聚合酶链反应(PCR)中，目的序列:引物:聚合酶混合物经历不同温度下加热的连续轮次，使目的DNA链去退火(通常在约90-99℃下进行)，引物:目的DNA链退火(通常在约40-70℃下进行)，以及DNA聚合酶介导的引物延伸(通常在约50-72℃下进行)，以产生新的互补扩增子链。反应可包括多达25-45轮循环以产生足够的扩增产物。

PCR通常使用热稳定的DNA聚合酶(Taq聚合酶是最广泛使用的)进行，这种酶可以承受高温去退火而不会因热诱导的蛋白质变性而失活。

众所周知，某些试剂或条件的存在可降低PCR的速度。这可能是一个重大的商业劣势，因为随着反应的放缓，成本增加，需要使用更多的加热:冷却循环。

SYBR^TM Green I核酸凝胶染色，DMSO中10,000倍浓缩(以下“SYBR Green I”)是一种不对称的花青染料(IUPAC名称：N'，N'-二甲基-N-[4-[(E)-(3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基)甲基]-1-苯基喹-1-啉-2-基]-N-丙基丙烷-1,3-二胺)，其在多种应用中用于核酸染色。SYBR Green I与DNA结合，产生的DNA-染料复合物吸收蓝光并发出绿光。它在PCR混合物中的存在可降低扩增速度。SYBR系列染料是由Life Technologies Corporation的全资子公司Molecular Probes Inc.生产的花青染料，还包括SYBR Safe(IUPAC名称：(Z)-4-((3-甲基苯并[d]噻唑-2(3H)-亚基)甲基)-1-丙基喹-1-啉4-甲基苯磺酸盐))以及SYBR Green II和SYBR Gold(在US Pat.No.5,436,134中描述，通过引用并入)。

因此，明显需要一种在包括SYBR Green I的SYBR染料的存在下可促进快速高效的PCR扩增的热稳定DNA聚合酶。

比较了具有突变序列的一些文献，权利要求14-17不包含以下文献中的任何突变序列：US Pat.NOS:.5,474,920；9523085B2；9493848B2；8,470,563B2；US公开号201401132999；和M.B.Kermekchiev等人，“Mutants of Taq DNA polymerase resistantto PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soilsamples”，Nucleic Acids Res.2009年4月；37(5):e40。

发明内容