[发明专利]CAS12a向导RNA分子及其用途

权利要求书

1.一种用于编辑人USH2A基因或人CFTR基因的Cas12a向导RNA(gRNA)分子，其包含：

(a)包含靶向序列的前间隔区结构域；和

(b)环结构域；

其中

(i)所述靶向序列对应于在人USH2A或人CFTR基因组DNA序列中的靶结构域；

(ii)所述靶结构域与Cas12a蛋白的前间隔区相邻基序(PAM)相邻；和

(iii)(a)在将所述gRNA和所述Cas12a蛋白引入包含所述基因组序列的人细胞后，所述Cas12a距所述基因组DNA编码的剪接位点的多达15个核苷酸切割所述基因组DNA和/或(b)所述PAM位于所述基因组DNA编码的剪接位点的40个核苷酸内。

2.权利要求1所述的Cas12a gRNA分子，其中所述剪接位点是隐性剪接位点，任选地其中所述隐性剪接位点由所述基因组DNA序列中的突变产生或者由所述基因组DNA序列中的突变激活。

3.权利要求2所述的Cas12a gRNA，其中所述隐性剪接位点由所述基因组DNA序列中的突变产生或者由所述基因组DNA序列中的突变激活，并且其中所述突变位于所述PAM序列3’端的1至23个核苷酸。

4.权利要求2或权利要求3所述的Cas12a gRNA，其中所述突变是单核苷酸多态性。

5.权利要求2至4中任一项所述的Cas12a gRNA，其中在所述隐性剪接位点处的剪接导致疾病表型。

6.权利要求2至5中任一项所述的Cas12a gRNA分子，其中所述隐性剪接位点是隐性3’剪接位点。

7.权利要求2至5中任一项所述的Cas12a gRNA分子，其中所述隐性剪接位点是隐性5’剪接位点。

8.权利要求1至7中任一项所述的Cas12a gRNA，其长度为40-44个核苷酸。

9.权利要求1至8中任一项所述的Cas12a gRNA，其中所述靶向序列的长度为20-24个核苷酸。

10.权利要求1至9中任一项所述的Cas12a gRNA，其中所述前间隔区结构域的长度为17-26个核苷酸。

11.权利要求1至10中任一项所述的Cas12a gRNA，其中所述靶向序列和所述靶结构域的互补序列之间不存在错配。

12.权利要求1所述的Cas12a gRNA，其中所述靶结构域是在人USH2A基因中。

13.权利要求12所述的Cas12a gRNA，其中所述USH2A基因具有c.7595-2144AG突变、IVS40-8CG突变或IVS66+39CT突变。

14.权利要求13所述的Cas12a gRNA，其中所述USH2A基因具有c.7595-2144AG突变。

15.权利要求14所述的Cas12a gRNA，其中所述靶结构域具有核苷酸序列TTAAAGATGATCTCTTACCTTGG(SEQ ID NO:90)、ACTTGTGTGATTCTGGAGAGGAA(SEQ ID NO:97)、CCAAGGTAAGAGATCATCTTTAA(SEQ ID NO:91)、AAATTGAACACCTCTCCTTTCCC(SEQ ID NO:92)、AAGATGATCTCTTACCTTGGGAA(SEQ ID NO:93)、AGCTGCTTTCAGCTTCCTCTCCAG(SEQ ID NO:94)、TGGAGAGGAAGCTGAAAGCAGCT(SEQ ID NO:95)或TGTGATTCTGGAGAGGAAGCTGA(SEQ ID NO:96)。