[发明专利]用于腺相关病毒产生的悬浮系统

说明书

本技术涉及一种用于在无血清悬浮平台中和高滴度下产生AAV载体的产生系统。这种技术所使用的试剂包括培养基、细胞、转染试剂、AAV增强剂和裂解缓冲液，其中的每一种都被设计成从哺乳动物细胞，例如HEK293细胞的悬浮培养物中提供最大AAV产生。使用这种新系统能够递送至多约2×10¹¹个病毒基因组每毫升(vg/mL)的非浓缩的AAV载体。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年2月22日提交的美国临时申请第62/809,407号的优先权和权益。前述申请的全部内容通过引用并入本文中。

背景技术

腺相关病毒(AAV)是一种会感染人和一些非人灵长类动物细胞的小DNA病毒。已知AAV不会引起疾病并且在人中具有低免疫原性。可以生产含有所关注的DNA序列、具有很少或没有病毒基因的AAV载体。这些优势使得AAV载体已在基因疗法和其它临床和研究目的中使用。

需要大规模产生AAV载体和产生高滴度的方法。

发明内容

本技术通常涉及一种在无血清悬浮平台中和高滴度下产生载体的新AAV系统。这种技术所采用的新开发的一组专有良好制造工艺(GMP)试剂包括培养基、细胞、转染试剂、AAV增强剂和裂解缓冲液，其中的每一个都被设计成从哺乳动物细胞的悬浮培养物中提供最大AAV产生。使用这种新系统能够递送至多约2×10¹¹个病毒基因组每毫升(vg/mL)的非浓缩的AAV载体(也就是说，在使用本文所描述的采集方法采集后尚未被进一步浓缩的载体)。

一方面，本文中提供了一种用于AAV载体产生的方法，所述方法包含：(i)培养哺乳动物细胞；(ii)使用转染试剂用AAV转移载体转染所述哺乳动物细胞；(iii)使经转染的细胞与AAV增强剂接触；(iv)以及将所述经转染的细胞在悬浮培养物中培养足以包装所述AAV载体的一段时间，由此产生经转染的AAV细胞培养物。在实施例中，在悬浮培养物中培养所述哺乳动物细胞。在实施例中，所述方法包含从所述经转染的AAV细胞培养物中采集AAV。在实施例中，使用裂解缓冲液采集所述AAV。在实施例中，所述转染步骤包含使所述细胞与转染促进剂接触。

在实施例中，所述方法包含对所采集的AAV进行滴定。在实施例中，使用定量PCR对所述AAV进行滴定。在实施例中，所述所采集的AAV的滴度为至少约2×10¹⁰个病毒基因组每毫升(vg/mL)。在实施例中，所述所采集的AAV的滴度介于约2×10¹⁰vg/mL与约2×10¹¹vg/mL之间。

在实施例中，以约10毫升(mL)到约800升(L)的体积培养所述细胞。在实施例中，以约1L到约10L的体积培养所述细胞。在实施例中，以约15毫升(mL)到约200升(L)的体积转染所述细胞。在实施例中，以约1L到约2L的体积转染所述细胞。

在实施例中，在生物反应器中培养所述细胞。

在实施例中，在支持HEK293细胞生长和扩增的培养基中培养所述细胞。在实施例中，在培养期间(例如，在转染后)使所述细胞与AAV产生增强剂接触。