[发明专利]用于脂质化蛋白质结构的制备的方法

权利要求书

1.用于制备缀合物的方法，其中所述缀合物包含生物分子、酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分，这种方法包括在水性介质中酶促偶联包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分与生物分子和缀合物的纯化。

2.根据权利要求1的方法，其中所述生物分子是多肽。

3.根据权利要求2的方法，其中所述生物分子是抗原、细胞黏着蛋白如整联蛋白或钙黏着蛋白，肽激素，如生长因子，细胞因子如白细胞介素，或与任何这些分子相关的受体，酶或天然或人工抗体或其片段。

4.根据权利要求3的方法，其中所述抗体是单克隆抗体或其片段，例如单链可变片段（scFv），可变片段（Fv），或抗原结合片段（Fab、Fab’或F(ab’)2）；骆驼科动物或软骨鱼来源的仅重链抗体或其片段，例如VHH或vNAR，或其中人工抗体是DARPin、adnectine、anticalin或affibody。

5.根据权利要求3或4的方法，其中所述生物分子是衍生自骆驼科动物仅重链抗体的可变结构域（VHH）的单结构域抗体。

6.根据权利要求1-5的方法，其中所述生物分子在其与包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分偶联之前携带C-末端基序用于通过转肽基酶，优选分选酶A进行酶促缀合。

7.根据权利要求6的方法，其中所述C-末端基序由氨基酸序列“亮氨酸-脯氨酸-X-苏氨酸-甘氨酸”（LPXTG）组成，其中“X”可以是任何蛋白原性氨基酸。

8.根据权利要求7的方法，其中存在于所述LPXTG基序中的所述蛋白原性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸，优选谷氨酸。

9.根据权利要求1-8中一项或多项的方法，其中所述酶标记是脂族胺，单甘氨酸，具有一个或多个N-末端甘氨酸，优选五甘氨酸的肽序列，其C-末端连接至亲水间隔基。

10.根据权利要求1-9中一项或多项的方法，其中所述亲水间隔基是聚氧(C₂-C₃)亚烷基（例如聚乙二醇或聚丙二醇）、多糖（例如葡聚糖、支链淀粉、壳聚糖、透明质酸）、多聚唾液酸、聚乙烯亚胺，优选聚乙二醇。

11.根据权利要求1-10中一项或多项的方法，其中所述接头是异谷氨酰胺，在与3-氨基-1,2-丙二醇连接的δ-位置酰胺上，且在与亲水间隔基连接的α-位置胺官能上。

12.根据权利要求1-11中一项或多项的方法，其中所述亲脂部分是一个或多个彼此独立的饱和或不饱和、直链或支链烃链，例如链长为6-30个碳原子的脂肪醇或脂肪酸，或甾醇如胆固醇。

13.根据权利要求12的方法，其中所述亲脂部分包含两种各自与3-氨基-1,2-丙二醇的二醇基团醚连接的肉豆蔻醇。

14.根据权利要求1-13中一项或多项的方法，其中所述包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分（组分A）是DMA-PEG-G5。

15.根据权利要求1-14中一项或多项的方法，其包括步骤

（a）制备包含酶标记、亲水间隔基、接头和亲脂部分的组分的水性分散体；

（b）添加酶和生物分子；

（c）温育在步骤（b）中获得的混合物以产生缀合物；

（d）纯化步骤（c）中获得的缀合物。