[发明专利]化合物的微生物生产

说明书

提供了经修饰宿主细胞，其通过工程化改造以在一种外源试剂存在下减少产物表达至不可检测水平，而在另一外源试剂存在下提高该产物的表达。修饰的酵母菌株宿主细胞不表达可检测水平的用于生成产物的前体或底物。该产物可为大麻素或其前体，底物可为己酸盐/酯。还提供了采用该经修饰宿主细胞制备产物的方法。经修饰宿主细胞可为酵母菌株，例如酿酒酵母(S.cerevisiae)。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年3月15提交的美国临时申请第62/819,457号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。

发明背景

在用生物体生产生物分子时，通常有一个外部控制的基因开关，在高生长、低生产模式(适合生物质的产生且易于处理)和低生长、高生产模式(适合有利的制造)之间切换是有益的。对于大多数发酵生产的生物分子，单开关机制已足够，即便其在低生产模式下实现多达10-20％的产率。对于一些生物分子，例如大麻素类，因监管要求产生了对低生产状态中极低或不可检测生产的需要。

从自然中发现了多种强单机制开关，包括酵母的半乳糖调控系统以及细菌中的阿拉伯糖调控系统。大部分是基于正常生理反应，其中在生物体感测到威胁或资源时，基因被激活。还有数种系统响应于在生物体环境中并不常有的分子——四环素、IPTG、靛蓝——其已被用于生物技术应用中。

发明概述

在一个方面中，提供了修饰的、工程化改造的或重组的宿主细胞，所述宿主细胞包含产生异源产物的异源遗传通路，且被外源试剂调控，其中所述宿主细胞不产生制备该产物所需的前体。在一些实施方式中，外源试剂包括基因表达调控物。

在一些实施方式中，外源试剂减少异源产物的产生。在一些实施方式中，减少异源产物产生的外源试剂是葡萄糖，由异源遗传通路编码的一种或多种酶的表达在葡萄糖阻遏型启动子的控制下。

在一些实施方式中，外源试剂增加异源产物的产生。在一些实施方式中，增加异源产物产生的外源试剂是半乳糖，由异源遗传通路编码的一种或多种酶的表达在GAL启动子的控制下。

在一些实施方式中，异源遗传通路包括半乳糖响应性启动子、麦芽糖响应性启动子或其组合。

在一些实施方式中，异源产物是大麻素或大麻素前体。在一些实施方式中，大麻素或大麻素前体是大麻二酚酸(CBDA)、大麻二酚(CBD)、大麻萜酚酸(CBGA)或大麻萜酚(CBG)。

在一些实施方式中，所述遗传通路编码至少两种选自下组的酶：己酰-CoA合酶(HCS)、四酮合酶(tetraketide synthase，TKS)和橄榄醇酸环化酶(OAC)。

在一些实施方式中，制备产物所需的前体为己酸盐/酯。

在一些实施方式中，异源遗传通路包括核酸构建体，所述构建体包含至少三个蛋白编码区。

在一些实施方式中，宿主细胞为酵母细胞或酵母菌株。在一些实施方式中，酵母细胞为酿酒酵母(S.cerevisiae)。

在另一方面，提供了一种混合物，所述混合物包含本文所述的宿主细胞以及培养基。在一些实施方式中，该培养基包含外源试剂，所述试剂减少异源产物的产生。在一些实施方式中，减少异源产物产生的外源试剂是葡萄糖、麦芽糖或赖氨酸。

在一些实施方式中，培养基包括：(i)外源试剂，其增加异源产物的生产；以及(ii)制备该异源产物所需的前体。在一些实施方式中，增加异源产物产生的外源试剂是半乳糖。在一些实施方式中，制备异源产物所需的前体为己酸盐/酯。

在另一方面，提供了减少异源产物表达的方法，所述方法包括在包含外源试剂的培养基中培养本文所述的宿主细胞，其中所述外源试剂减少所述异源产物的表达。在一些实施方式中，减少异源产物表达的外源试剂是葡萄糖、麦芽糖或赖氨酸。在一些实施方式中，在包含外源试剂的培养基中培养宿主细胞株致使产生少于0.001mg/L的异源产物。