[发明专利]6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途

说明书

6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体及其在制备检测试剂中的用途。6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型6‑磷酸葡萄糖脱氢酶包含以下突变的组合：56C、306C和454C。使用6‑磷酸葡萄糖脱氢酶突变体所制备的检测试剂盒，特异性强、灵敏度高、操作方便、检测时间短、定量准确，适合高通量检测。

技术领域

本申请涉及生物检测领域，特别是涉及一种多位点突变的酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶(简称G6PDH)及其在检测试剂盒中的应用。

背景技术

半抗原，某些小分子物质(分子量小于4000Da)，其单独不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当其与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合后可获得免疫原性，诱导免疫应答。这些小分子物质可与应答效应产物结合，具备抗原性，它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。

半抗原能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应，又不能单独激发人或动物体产生抗体的抗原。它只有免疫反应性，不具免疫原性，又称不完全抗原。大多数多糖、类脂、激素、小分子药物都属于半抗原。如果用化学方法把半抗原与某种蛋白分子(载体)结合，会获得新的免疫原性，并能刺激动物产生相应的抗体。

小分子抗原(或半抗原)因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，多采用竞争模式。原理是样本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。样本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，显色愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。

目前已知的半抗原检测方法主要有：放射免疫分析法、酶联免疫法、化学发光免疫分析法、高效液相色谱法、气液色谱法、气相色谱法和质谱联用等。但这些检测方法均存在较多的缺陷，如放射免疫分析法同位素具有放射性污染、有效期较短、操作不方便等诸多弊端，酶联免疫吸附法操作较为繁琐、耗时较长，不适宜在临床上使用。化学发光尽管灵敏度较好，但需要配套的专用设备，投入使用成本较高不利于推广。在临床检测诊断过程中，以均相酶免疫法(EMIT)和胶乳增强免疫比浊法检测为主。

均相酶免疫测定的原理：在液体均相反应体系中，酶标记抗原与非标记抗原，竞争与定量的抗体进行结合，当抗体与非标记抗原结合越多，酶标记抗原释放的活性就越多，酶催化底物NAD+生成NADH就越多，在340nm波长下检测NADH的吸光度变化，即可推算出液体中半抗原的含量。

现有技术的方法依赖于对半抗原(如小分子药物)自身所带反应基团进行的激活，之后再与酶进行反应。这样的偶联方法会出现同一葡萄糖六磷酸脱氢酶上链接有多个小分子药物的情况，且偶联位点难以确保一致性，难以保证小分子药物和酶之间的定向1：1反应，而导致批间差异大。

发明内容

鉴于本领域的需求，本申请提供了一种新型的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体、及其在制备检测试剂中的用途。

根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。相较于野生型，本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，其包含选自以下的突变组合：56C、306C和454C。

本申请的突变体，区别于已发表专利中的6磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，例如US006090567A(Homogeneous immunoassays using mutant glucose-6-phosphatedehydrogenases)，也不同于CN110174363A中公开的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体相较于野生型包含D306C、D375C或G426C的单突变体。

根据一些实施方案，提供了一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体，所述6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体是以下序列所示：SEQ ID No.2。

根据一些实施方案，提供了一种多核苷酸，其编码本申请的6-磷酸葡萄糖脱氢酶突变体。

根据一些实施方案，提供了一种表达载体，其包含本申请的多核苷酸。