[发明专利]用于制造重组病毒载体的方法

权利要求书

1.生产重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述质粒载体包含异源核苷酸序列以及复制和包装基因序列；

b)在允许病毒复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的病毒载体，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组病毒载体选自逆转录病毒载体、腺病毒载体和AAV载体。

3.生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用至少两种质粒载体共转染合适的细胞培养物，所述载体包含侧翼为ITR、AAV rep和AAV cap基因序列的异源核苷酸序列以及腺病毒辅助功能序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；

c)回收步骤b)中产生的AAV，并在允许进一步分裂和生长的条件下将细胞保留在所述细胞培养物中；

d)用步骤a)的质粒载体重新转染步骤c)的细胞；以及

e)重复步骤b)到c)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤b)中，AAV被分泌到细胞培养物的上清液中。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在步骤d)之前交换所述细胞培养物的细胞培养基。

6.根据权利要求5的方法，其中，通过灌注进行细胞培养基交换。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，在恢复步骤c)之后至少再重复步骤d)、b)和c)一次。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，步骤b)是通过在搅拌的液体培养基中悬浮培养所述细胞来进行的。

9.根据权利要求3至8任一项所述的方法，其中，在步骤a)中使用以下三种质粒载体：

i)第一质粒载体，其特征在于质粒骨架大小大于5000pb，优选在7000bp到7500bp之间，并且包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列和位于所述ITR外部，优选与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400pb到4800pb之间；

ii)包含从5'到3'的AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体；以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列。

10.根据权利要求8或9中任一项的方法，其中，所述第一质粒载体在主链序列中不含F1Ori核苷酸序列。

11.生产重组AAV的方法，所述方法包括以下步骤：

a)将合适的细胞与以下共转染

i)包含侧翼为ITR的异源核苷酸序列的第一质粒载体；

ii)包含从5'到3'AAV rep编码区、AAV cap编码区和包含AAV p5启动子区的核苷酸序列的第二质粒载体，以及

iii)包含腺病毒辅助功能的第三质粒载体，包括VA-RNA、E2A和E4序列，其中所述质粒不包含E3、pTB(E2B)和Ad ITR蛋白酶序列；

b)在允许AAV复制和包装的条件下培养所述细胞；以及

c)回收步骤b)中产生的AAV。

12.根据权利要求11的用于生产重组AAV的方法，其中，所述第一质粒载体i)的特征在于质粒骨架大小大于5000pb，优选在7000bp到7500bp之间，并且它包含位于所述ITR之外，优选地与一个ITR相邻的填充DNA序列，其中所述填充序列的长度在4400pb到4800pb之间。