[发明专利]敲入细胞的制作方法

说明书

发现了通过利用位点特异性核酸酶系统，能够在基因组DNA与供体DNA之间引起利用非同源末端结合和同源重组双方的修复，以高的效率和正确性制作敲入了长链的供体序列的细胞、生物，所述位点特异性核酸酶系统包含：同时靶向供体DNA的一方的同源臂序列和该同源臂序列所对应的基因组序列而进行切割的分子、和靶向该分子的切割位点的附近基因组区域而进行切割的分子的组合。

技术领域

本发明涉及利用了位点特异性核酸酶系统和供体DNA的敲入细胞或敲入生物的制作方法、和用于该方法的试剂盒或组合物。

背景技术

锌指核酸酶(zinc finger nuclease；ZFN)、TAL效应物核酸酶(transcriptionactivator-like effector nuclease；TALEN)、CRISPR-Cas9等的基因组编辑技术是通过在动物、植物的细胞中特异性地切割基因组DNA序列，从而利用内在的修复机制，自由地重写任意序列的技术。不仅在生物科学研究中，其应用迅速推广到农作物/畜产动物的品种改良、再生医疗、基因组编辑治疗等。

如果将CRISPR/Cas9(非专利文献1)导入小鼠受精卵，则向导RNA与靶标DNA序列结合，与该向导RNA形成了复合体的Cas9将靶标DNA双链切割。并且，被称为非同源末端结合(non-homologous end joining；NHEJ)的DNA修复机制在该切割位点发挥作用。经由该DNA修复机制在小鼠受精卵的基因组DNA中导入基因突变，从而能够制作敲除小鼠。另一方面，如果将具有与基因组DNA同源的序列的供体DNA与CRISPR/Cas9一起导入小鼠受精卵，则能够经由同源重组(homologous recombination；HR)，制作重组了基因的敲入小鼠。

2013年报告了使用CRISPR/Cas9制作的敲除小鼠和敲入小鼠(非专利文献2、3)。现在，基因的敲除能够非常高效地实施，但关于敲入，在细胞、受精卵中其效率尚低。

近年来，开发了除了利用使用现有的双链DNA供体载体的同源重组的敲入以外各种方法。例如，报告了通过将单链寡聚供体DNA(ssODN)与CRISPR/Cas9一起注射到细胞、受精卵中，能够有效地敲入1～数十碱基的供体序列(非专利文献4、5)。另外，本发明者开发了能够通过用Cas9切割靶标DNA序列和供体载体，用二个ssODN结合切割位置，从而敲入数千碱基的质粒、二十万碱基的BAC载体2-Hit 2-Oligo(2H2OP)法(非专利文献6)。进而报告了通过利用长链单链供体DNA的Easi-CRISPR法(非专利文献7)、组合了长链单链供体DNA与电穿孔法的CLICK法(非专利文献8)，制作条件小鼠、GFP报告物敲入小鼠。另外，作为利用双链供体DNA进行敲入的方法，报告了利用Cas9蛋白和两分子的向导RNA的无克隆法(非专利文献9)、利用由微同源介导的MMEJ修复机制的PITCH法(非专利文献10)、非同源末端结合依赖性地进行敲入的HITI法(非专利文献11)、同源序列依赖性地进行敲入的HMEJ法(非专利文献12)或Tild-CRISPR法(非专利文献13)等。

报告了这些方法能够在细胞中高效地敲入数千碱基的DNA，但在动物受精卵中有时效率低、不能正确地敲入。这是因为，在哺乳动物的细胞、受精卵中，双链DNA切割修复时非同源末端结合优势地发挥作用，利用同源重组的修复仅稀少地发生。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Jinek M,et al.,Science.337(6096):816-21(2012)

非专利文献2：Yang H,et al.,Cell.154(6):1370-9(2013)

非专利文献3：Wang H,et al.,Cell.153(4):910-8(2013)

非专利文献4：Sander JD,et al.,Nat Biotechnol.32(4):347-55(2014)