[发明专利]用于对样本成像的荧光扫描显微镜和方法

说明书

介绍了一种荧光扫描显微镜，其包括：激发光源，该激发光源被设计用于产生激发光分布，该激发光分布激发存在于样本中的荧光团，以便自发地发射荧光光子；去激发光源，该去激发光源被设计用于产生去激发光分布，该去激发光分布通过荧光光子的受激发射来使得由所述激发光分布在所述样本中激发的荧光团去激发；照明单元，该照明单元被设计用于将所述激发光分布和所述去激发光分布合并成沿着所述样本的多个照明目标点扫描的光分布，使得所述激发光分布的强度最大值和所述去激发光分布的强度最小值在相应的照明目标点中在空间上相互叠加；探测器，该探测器被设计用于检测从所述相应的照明目标点发射的荧光光子(根据这些荧光光子的到达时间)；和处理器。该处理器被设计用于，评估在所述相应的照明目标点中检测到的荧光光子的到达时间；基于所述评估生成代表相应照明目标点的第一图像点和第二图像点；把所述第一图像点合并成第一样本图像，并且把所述第二图像点合并成第二样本图像；并且，借助两个样本图像来确定在所述激发光分布的强度最大值和所述去激发光分布的强度最小值之间的空间偏移。

技术领域

本发明涉及一种荧光扫描显微镜以及一种使用荧光扫描显微镜对样本成像的方法。

背景技术

在荧光显微术领域，为了样本的高分辨率成像，通常采用所谓的STED方法，其中，利用由激发光和去激发光叠加产生的光分布来照射样本。在此，STED表示“受激发射损耗”。在此，激发光旨在激发存在于样本中的荧光团，以便自发发射荧光。相比之下，去激发光(其波长不同于激发光的波长)用于通过荧光的受激发射来去激发由激发光激发的荧光团。为了提高图像分辨率，给激发光叠加具有特殊光分布的去激发光，该激发光以激光束的形式聚焦到样本中的相应的照明目标点上。这种去激发光分布具有强度零点和与其邻接的尽量陡峭地上升的强度边沿。为了获得尽可能最佳的图像分辨率，必须将去激发光分布叠加在激发光分布上，使去激发光分布的零点与激发光分布的强度最大值精确地重合。如果确保了这一点，则在照明目标点中抑制在激发光分布的外部区域中的荧光自发发射，从而仅从在去激发光分布的零点周围的区域探测自发发射的荧光。如果该样本区域采用扫描方法移动经过样本的大量照明目标点，则可以通过探测不受去激发光分布抑制的荧光来获得样本的高分辨率图像。

如果不能确保去激发光分布的零点与激发光分布的最大值重合，则会出现两种降低图像质量的效应。首先，在去激发光和激发光叠加中的失准调节导致图像亮度的降低。其次，这种失准调节突出了在激发光分布中的不希望有的次生最大值。在图1中示出了这两种效应，其中，为了简单起见，在那里假设在方向x上的一维光分布。

图1a示出了去激发光和激发光最佳叠加的情况。在此，实线表示激发光分布E，虚线表示去激发光分布D。在这种最佳情况下，去激发光分布D的由N表示的零点在x方向上与激发光分布E的最大值M精确地叠加。

图1c示出了在相应的照明目标点中探测到的荧光分布，该荧光分布由根据图1a的去激发光和激发光的最佳叠加而产生。这种荧光分布示出高强度的且尖锐的最大值，该最大值的较小的半宽决定了在方向x上的空间分辨率。

相比之下，图1b示出了失准调节的情况，其中，去激发光分布D的零点N与激发光分布E的最大值M不重合。这种失准导致在图1d中示出的荧光分布。如与图1c相比可以看出，去激发光和激发光的不精确叠加导致荧光分布的最大值明显减小。此外，在荧光分布中出现显着的次生最大值，如图1d中的箭头所示。这种次生最大值出现在x方向上的一些点处，在这些点处，荧光激发通过去激发光分布没有猝灭到足够的程度。