[发明专利]从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法

权利要求书

1.从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：

-培养所述人多能干细胞以获得分化细胞，以及

-使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述眼野祖细胞是眼睛的不同细胞谱系的多种祖细胞，包括但不限于视杯祖细胞，如RPE祖细胞和NR祖细胞、晶状体祖细胞和角膜祖细胞。

3.从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：

-将所述人多能干细胞接种在用基质包被的基底上，

-在细胞培养基中培养所述人多能干细胞，以获得分化细胞，

-使所述分化细胞与Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂接触，以及

-使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触，

其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中BMP5的浓度为约0.1ng/ml至约2500ng/ml，优选约100ng/ml至约500ng/ml，更优选约150ng/ml至约450ng/ml，甚至更优选约200ng/ml至约400ng/ml。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与选自GW788388、LDN-193189、LY2157299、LY364947、NOGGIN、RepSOX、SB431542和TEW-7197的Small MothersAgainst Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂为GW788388和/或RepSOX。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述基质为选自层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-521和层粘连蛋白-332或其组合的层粘连蛋白或其片段。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从大约第5天至大约第15天起，优选地从大约第6天至大约第12天起，更优选地从大约第6天至大约第8天起，甚至更优选地从大约第7天起，使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中从大约第0天至大约第15天起，优选地至大约第14天起，更优选地至大约第13天起，甚至更优选地至大约第12天起，使所述分化细胞与Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂接触。

11.根据权利要求2-11所述的方法，其中所述眼野祖细胞是RPE祖细胞，并且其中所述方法进一步包括以下步骤：

-使所述分化细胞与GSK3抑制剂接触。

12.根据权利要求11所述的方法，其中从大约第7天至大约第15天起，优选地从大约第12天起，使所述分化细胞与所述GSK3抑制剂接触。

13.根据权利要求11和12中任一项所述的方法，其中所述GSK3抑制剂为CHIR99021。

14.眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少40％的眼野祖细胞共表达PAX6和OTX2，以及VSX2和/或MITF中的至少一种。

15.根据权利要求14所述的眼野祖细胞的体外细胞群体，其中至少50％、60％、70％、80％或90％的眼野祖细胞共表达PAX6和OTX2，并且至少10％、20％、30％、40％、50％的眼野祖细胞进一步共表达VSX2和/或MITF中的至少一种。