[发明专利]用于基于核苷酸修饰的耗竭的组合物和方法

权利要求书

1.一种使样品富集所关注核酸的方法，所述方法包括：

a.提供包括所关注核酸和旨在被耗竭的核酸的样品，其中所述所关注核酸的至少一个子集或所述旨在被耗竭的核酸的子集包括用于第一修饰敏感性限制酶的多个第一识别位点；

b.使所述样品中的多个所述核酸末端去磷酸化；

c.在允许切割所述样品中的所述核酸中的所述第一修饰敏感性限制位点中的至少一些的条件下，使来自(b)的所述样品与所述第一修饰敏感性限制酶接触；以及

d.在允许衔接子与多个所述所关注核酸的5'端和3'端连接的条件下，使来自(c)的所述样品与所述衔接子接触；

由此产生富集所关注核酸的样品，所述所关注核酸在其5'端和3'端上衔接子连接。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述所关注核酸和所述旨在被耗竭的核酸两者均包括用于所述第一修饰敏感性限制酶的多个第一识别位点。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述多个第一识别位点内或邻近所述多个第一识别位点的核苷酸修饰在所关注核酸中的频率与在所述旨在被耗竭的核酸中的频率不同。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述第一修饰敏感性限制酶的活性被其同源识别位点内或邻近所述同源识别位点的核苷酸修饰所阻断。

5.根据权利要求4所述的方法，其中与所述所关注核酸中的所述多个第一识别位点相比，所述旨在被耗竭的核酸中的所述多个第一识别位点被更频繁地修饰。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述第一修饰敏感性限制酶包括选自由以下组成的组的限制酶：AatII、AccII、Aor13HI、Aor51HI、BspT104I、BssHII、Cfr10I、ClaI、CpoI、Eco52I、HaeII、HapII、HhaI、MluI、NaeI、NotI、NruI、NsbI、PmaCI、Psp1406I、PvuI、SacII、SalI、SmaI、SnaBI、AluI和Sau3AI。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述第一修饰敏感性限制酶包括选自由AluI和Sau3AI组成的组的限制酶。

8.根据权利要求1到3所述的方法，其中所述第一修饰敏感性限制酶在包括至少一个经修饰核苷酸的识别位点处有活性，而在不包括至少一个经修饰核苷酸的识别位点处没有活性。

9.根据权利要求8所述的方法，其中与所述所关注核酸中的所述多个第一识别位点相比，所述旨在被耗竭的核酸中的所述多个第一识别位点被更频繁地修饰。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述第一修饰敏感性限制酶包括选自由以下组成的组的限制酶：AbaSI、FspEI、LpnPI、MspJI或McrBC。

11.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述修饰包括5-羟甲基胞嘧啶，

所述第一修饰敏感性限制酶包括AbaSI，并且所述方法进一步包括在步骤(c)之前使所述样品与T4噬菌体β-葡糖基转移酶接触。

12.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述修饰包括葡糖基羟甲基胞嘧啶，并且所述第一修饰敏感性限制酶包括AbaSI。

13.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述修饰包括甲基胞嘧啶，并且所述第一修饰敏感性限制酶包括McrBC。

14.根据权利要求8到13中任一项所述的方法，其中所述所关注核酸包括至少一个DpnI识别位点，并且其中所述方法进一步包括在步骤(c)之前使所述样品与DpnI和T4聚合酶接触，由此在所述至少一个DpnI识别位点内或邻近所述至少一个DpnI识别位点处用未甲基化的A和C核苷酸置换甲基化的A和C核苷酸。