[发明专利]末端脱氧核苷酸转移酶变体及其用途

权利要求书

1.一种末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，所述TdT变体包含与选自SEQ ID NO:11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的氨基酸序列中所列的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含第173位处的半胱氨酸残基(对于SEQ ID NO:11、13、17、19、21、29或31)，或功能等效的半胱氨酸残基的至少一个氨基酸取代，所述功能等效的半胱氨酸残基选自第172位处的半胱氨酸(对于SEQ ID NO:15)、第178位处的半胱氨酸(对于SEQ ID NO:23)、第174位处的半胱氨酸(对于SEQ ID NO:25)、第171位处的半胱氨酸(对于SEQ ID NO:27)、第182位处的半胱氨酸(对于SEQ ID NO:33)或第176位处的半胱氨酸(对于SEQ ID NO:35)，其中所述TdT变体(i)能够在无模板的情况下合成核酸片段和(ii)能够使修饰的核苷酸掺入核酸片段中。

2.如权利要求1所述的TdT变体，所述TdT变体具有第63位处的蛋氨酸残基(对于SEQ IDNO:11、13、15、17、19、29或33)，或功能等效的蛋氨酸残基的另外的取代，所述功能等效的蛋氨酸残基选自第73位处的蛋氨酸(对于SEQ ID NO:23)、第73位处的蛋氨酸(对于SEQ IDNO:23)、第64位处的蛋氨酸(对于SEQ ID NO:25)、第61位处的蛋氨酸(对于SEQ ID NO:27)或第66位处的蛋氨酸(对于SEQ ID NO:35)。

3.如权利要求1或2所述的TdT变体，所述TdT变体具有第207位处的精氨酸残基(对于SEQ ID NO:11、13、17、19、23、29或31)，或功能等效的精氨酸残基的另外的取代，所述功能等效的精氨酸残基选自第206位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:15)、第208位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:21或25)、第205位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:27)、第216位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:33)或第210位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:35)。

4.如前述权利要求中任一项所述的TdT变体，所述TdT变体具有第324位处的精氨酸残基(对于SEQ ID NO:11或13)，或功能等效的精氨酸残基的另外的取代，所述功能等效的精氨酸残基选自第320位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:15)、第331位处的精氨酸(对于SEQ IDNO:17)、第325位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:19、23或31)、第326位处的精氨酸(对于SEQID NO:25)、第323位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:27)、第328位处的精氨酸(对于SEQ IDNO:29)、第338位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:33)或第328位处的精氨酸(对于SEQ ID NO:35)。

5.如前述权利要求中任一项所述的TdT变体，所述TdT变体具有第327位处的谷氨酸残基(对于SEQ ID NO:11或13)，或功能等效的谷氨酸残基的另外的取代，所述功能等效的谷氨酸残基选自第334位处的谷氨酸(对于SEQ ID NO:17或21)、第331位处的谷氨酸(对于SEQID NO:29或35)、第328位处的谷氨酸(对于SEQ ID NO:19、23或31)、第329位处的谷氨酸(对于SEQ ID NO:25)、第326位处的谷氨酸(对于SEQ ID NO:27)或第341位处的谷氨酸(对于SEQ ID NO:33)。

6.如前述权利要求中任一项所述的TdT变体，其中所述半胱氨酸的所述取代为G、R、P、A、V、S、N、Q或D，优选为G或R。

7.如权利要求2至6中任一项所述的TdT变体，其中所述蛋氨酸的所述取代为R、Q、G、A、V、D、N、H或E，优选为R或Q。

8.如权利要求3至7中任一项所述的TdT变体，其中所述精氨酸的所述取代为N、L、K、H、G、D、A或P，优选为N或L。