[发明专利]用于艰难梭菌感染和复发性感染管理的工程化菌群失调感测益生菌

权利要求书

1.一种表达盒，所述表达盒包含：

i.胆盐水解酶基因，以及

ii.与所述胆盐水解酶基因可操作地连接的唾液酸响应型启动子。

2.根据权利要求1所述的表达盒，其中所述胆盐水解酶基因是来自产气荚膜梭菌的Cbh蛋白编码多核苷酸序列，其优选地编码SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列或其功能变体。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其中所述Cbh蛋白编码多核苷酸序列包含与SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9中列出的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的表达盒，其中所述唾液酸响应型启动子是来自大肠杆菌的pNanA，其优选地包含SEQ ID NO:4中列出的核酸序列或其功能变体。

5.根据权利要求4所述的表达盒，其中当在不存在唾液酸的情况下存在pNanA的表达时，将pNanA的阻遏子定位于pNanA的上游，其中优选地所述阻遏子是NanR蛋白编码多核苷酸序列，其优选地编码SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列或其功能变体。

6.根据权利要求5所述的表达盒，其中所述NanR蛋白编码多核苷酸序列包含与SEQ IDNO:5中列出的核酸序列具有至少80％序列同一性的核酸序列。

7.根据权利要求5或6所述的表达盒，所述表达盒还包含与NanR可操作地连接的组成型启动子，其中所述启动子选自包括以下的组：具有AraC的pBad；具有rbs2、rbs 3或rbs 5的J23108；和具有rbs 4的J23113。

8.根据权利要求7所述的表达盒，其中所述与NanR可操作地连接的组成型启动子是J23113-rbs4。

9.根据权利要求8所述的表达盒，其中所述盒包含J23113-rbs4-NanR，其优选地包含SEQ ID NO:6中列出的核酸序列或其功能变体。

10.根据权利要求5至9中任一项所述的表达盒，所述表达盒还包含激活子和启动子以增加Cbh的表达，如转录激活因子CadC蛋白编码序列和启动子pCadBA，其中CadC定位于pNanA的下游并受其控制，并且pCadBA定位于CadC的下游并与所述胆盐水解酶Cbh蛋白编码序列可操作地连接。

11.根据权利要求10所述的表达盒，其中所述激活子和启动子核酸序列在SEQ ID NO:7中列出或为其功能变体。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的表达盒，其中所述盒包含在一种或多种质粒载体中。

13.根据权利要求12所述的表达盒，其中所述质粒载体是pEaat，其优选地包含SEQ IDNO:1中列出的核酸序列或其功能变体。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的表达盒，所述表达盒还包含抗生素抗性基因，其侧翼为FRT位点以使得所述抗生素抗性基因能够被去除。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的表达盒，其中cbh的基因多核苷酸序列经密码子优化以在益生菌细胞中表达，如在SEQ ID NO:9中所列。

16.根据权利要求15所述的表达盒，其中cbh的基因多核苷酸序列经密码子优化以在益生菌细胞中表达，所述益生菌细胞选自包括以下的组：大肠杆菌物种、拟杆菌属物种、梭菌属物种、栖粪杆菌属物种、乳酸乳球菌和乳杆菌属物种。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的表达盒用于重组产生胆盐水解酶蛋白的用途。