[发明专利]使用能量转移染料对边合成边测序

权利要求书

1.一种对核酸进行测序的方法，所述方法包括：

a)提供与引物杂交的至少一个核酸模板；

b)提供第一核酸聚合酶，并且如果荧光标记的核苷酸类似物与紧邻与所述引物的3'端核苷酸残基杂交的所述核酸模板的核苷酸残基的5'的核苷酸残基互补，则使用所述第一核酸聚合酶和所述核苷酸类似物延伸所述与所述至少一个核酸模板杂交的引物，其中所述核苷酸类似物是：

(i)荧光标记的核苷酸类似物，所述荧光标记的核苷酸类似物包括碱基和荧光标记以及通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的所述碱基的封闭基团，其中所述封闭基团防止或大大减少后续核苷酸类似物并入到延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；或者

(ii)荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物，所述荧光标记的可逆封闭的核苷酸类似物包括碱基和通过可切割接头附接到所述核苷酸类似物的荧光标记以及在3'-OH位置处的封闭基团，其中所述封闭基团防止后续核苷酸类似物并入到所述延伸的引物链中，并且其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料；

c)去除所述第一核酸聚合酶并且提供具有附接的荧光标记的第二核酸聚合酶，其中所述荧光标记包括能量转移受体或供体染料，所述能量转移受体或供体染料针对附接到步骤b中所述核苷酸类似物的所述能量转移受体或供体染料；

d)鉴定由于所述荧光标记的核苷酸类似物并入到所述引物上而产生的荧光信号；

e)任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；

f)从步骤b)的任何并入的核苷酸类似物中切割所述标记和所述封闭基团；

g)其中如果未在步骤d)中检测到荧光信号，则使用具有不同碱基的荧光标记的核苷酸类似物迭代地重复步骤b)到f)，直到并入所述荧光标记的核苷酸类似物为止；

h)如果没有执行任选的追踪步骤e)，则任选地使用不具有任何碱基修饰的3'封闭的核苷酸类似物延伸任何未延伸的引物；

i)对所述核酸模板的每个核苷酸残基迭代地执行步骤b)到h)，

由此确定所述核酸模板的序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物具有附接到所述碱基或在所述3'-OH位置处的封闭基团。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核苷酸类似物上的染料是Cy5或ATTO647N，并且步骤c)的所述第二核酸聚合酶上的染料是Cy3，和/或其中所述碱基上的所述可切割接头是DTM。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物的3'封闭基团是DTM或叠氮基甲基，并且使用THP进行所述切割。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移供体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移受体染料，或者其中所述荧光标记的核苷酸类似物上的染料是能量转移受体染料并且第二核苷酸聚合酶上的染料是能量转移供体染料，和/或其中所述核苷酸类似物和/或第二核酸聚合酶上的染料是染料簇。

6.根据权利要求1到3和5中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物选自图4和/或图9的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。

7.根据权利要求1到5中任一项所述的方法，其中所述荧光标记的核苷酸类似物选自图5的核苷酸类似物中的任何一种核苷酸类似物。

8.一种试剂盒，其包括用于执行根据权利要求1到7所述的方法的所有所需核苷酸类似物、聚合酶、可切割剂和其它反应缓冲液组分。