[发明专利]用于合成高分子量共聚物的基因

说明书

本发明的目的在于提供红树林土壤宏基因组来源的聚合物合成酶基因以及使用该聚合物合成酶的有用共聚物的制备方法。另外，本发明的另一目的在于提供链霉菌属CFMR7来源的烯酰CoA水合酶基因以及通过该烯酰CoA水合酶的表达而3HHx的组成增加的有用共聚物P(3HB‑co‑3HHx)的制备方法。为了实现上述目的，本发明提供一种分离的多核苷酸，其编码多肽，该多肽含有序列编号1或3所记载的氨基酸序列或者1个以上的氨基酸经取代、缺失或插入的序列编号1或3所记载的氨基酸序列，且具有聚合物合成酶活性或水合酶活性。

技术领域

本发明涉及红树林土壤宏基因组来源的聚合物合成酶编码基因以及链霉菌属CFMR7(保藏编号：CP011522)来源的烯酰CoA水合酶编码基因。更详细而言，本发明对分别编码聚合物合成酶和烯酰CoA水合酶的功能基因进行详细说明，两种功能基因一起使用时能够实现高分子量共聚物的合成。

背景技术

聚羟基烷酸酯(PHAs)是在营养不足和压力条件下作为存储化合物(储备碳)由微生物(细菌和古细菌)生成的生物聚酯。与合成塑料相比，PHA的主要优点是具有与石油化学来源的塑料相同的物理化学的特性，此外还具有可生物降解性、生物相容性和可持续性。参与PHA聚合的重要酶是PHA合成酶(PhaC)。PhaC这种酶颇为神奇，它能够在细胞质的亲水性环境中使高分子量的疏水性PHA链聚合。

目前关于PHA多样性的见解中，PHA生产者(producer)和PhaC主要是通过采用培养依存方式得到纯微生物分离物的相关研究而获得的。有报告称基于属的共计4种PhaC及167PHA生产者来自现有的可培养土壤微生物，这些现有的可培养土壤微生物占土壌微生物整体的15％以下。其余85％未进行过调研。因此，从该未调研的微生物群资源来看，在理解PHA生产者多样性方面存在巨大的见解偏差。

红树林土壤生物群系统包含高度的微生物多样性持续面临生理盐水和无氧状态等各种非生物胁迫。一些研究中报告了从红树林环境中分离出PHA生产者。但是对于与红树林土壤宏基因组来源的PhaC相关的研究没有过报道。因此从红树林土壤宏基因组中的新微生物属、特别是难以在研究室中培养的厌氧微生物中发现大量新型PhaC的可能性很高。

PHA的特性是通过控制二级单体的整合和/或组成从而能够适用于各种用途。细菌的PHA根据单体单元中的碳原子数主要分为短链长(scl)、中链长(mcl)以及scl-mcl的组合这3种类型。scl-PHA由3～5个碳原子构成，mcl-PHA具有6～14个碳原子，而scl-mcl-PHA中每个单体的碳原子数可以在3～14个的范围内。生成的PHA的种类取决于聚合物合成酶的底物特异性。主要由scl单体构成的PHA通常硬且脆，而主要由mcl单体构成的PHA本质上具有弹性。Scl-mcl PHA共聚物取决于共聚物中scl单体与mcl单体之比可具有两种状态之间的特性。

由phaJ编码的烯酰CoA水合酶显示(R)特异性水合酶活性，具体而言，在生物合成中将(R)-3-羟基酰基-CoA单体单元、例如由脂肪酸β氧化得到的3-羟基己酸酯辅酶A(3HHx-CoA)供给给聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基己酸酯)[P(3HB-co-3HHx)]共聚物。

作为与聚合物合成酶及其编码基因相关的现有技术，已报道有一些专利文献。专利文献1(美国专利第6，812，013号)涉及PHA的制备工艺中有用的PHA合成酶、该酶的编码基因、含有该基因的重组载体、利用该载体转化得到的转化子、利用该转化子进行的PHA合成酶的生成工艺以及利用该转化子进行的PHA的制备工艺。该发明的特征在于，向通过培养生成PHA合成酶或PHA的宿主微生物中导入Pseudomonas putida来源的PHA合成酶基因得到转化子。

另外，专利文献2(美国专利第2004-146998号)涉及转化子以及使用该转化子制备聚合物的生成工艺。该发明公开了编码共聚物合成酶的基因、利用该基因得到的聚合物的发酵合成用微生物、以及基于微生物的聚合物生成方法。该发明着重于构筑含有聚酯合成相关酶基因、启动子和终止子并导入酵母的转化子。