[发明专利]三萜制备

说明书

表达β‑香树素合酶、细胞色素P450还原酶、细胞色素P450 C28氧化酶、细胞色素P450 C16氧化酶和细胞色素C23氧化酶的工程化微生物细胞用于从β‑香树素制备皂皮酸。

引言

皂皮酸是在位置3和16处具有羟基基团、在位置23处具有醛基团且在位置28处具有羧酸的五环三萜类化合物(图1)，并且已被证明具有有用的药用性质，例如Rodríguez-Díaz M等人，Topical anti-inflammatory activity of quillaic acid from Quillajasaponaria Mol.and some derivatives.JPharm Pharmacol.2011May；63(5):718-24。皂皮酸的化学合成或生物合成途径均未知，并且因此，对皂皮酸制备方法的需求未得到满足。

发明概述

本发明提供了用于制备β-香树素氧化产物，诸如皂皮酸、皂皮酸前体及其还原和氧化形式的方法、组合物和系统，诸如工程化细胞。

一方面，本发明提供了一种制备氧化三萜的方法，其包括在其中C28氧化酶、C16氧化酶和C23氧化酶分别将β-香树素的C28、C16和C23碳分别氧化成羧基、羟基和甲酰基(醛)的条件下，孵育表达β-香树素合酶、细胞色素P450还原酶、细胞色素P450 C28氧化酶、细胞色素P450 C16氧化酶和细胞色素C23氧化酶的工程化微生物细胞或使其生长，以形成氧化三萜。

在实施方案中：

微生物细胞是酵母细胞，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)；

微生物细胞是产油酵母细胞，诸如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)或斯达油脂酵母(Lipomyces starkey)；

微生物细胞是细菌细胞，诸如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或链霉菌属细菌(Streptomyces spp.)；

将微生物细胞工程化以表达植物β-香树素合酶以使类异戊二烯或天然甾醇生物合成途径转向；

细胞色素P450还原酶选自：拟南芥细胞色素P450还原酶(AtATR1)和百脉根(Lotusjaponicus)细胞色素P450还原酶(LJCPR)；

细胞色素P450 C16氧化酶选自：CYP87D16和CYP716Y1；

细胞色素P450 C23氧化酶选自：CYP72A68和CYP714E19；

细胞色素P450 C28氧化酶选自：CYP716A1、CYP716A12、CYP716A15、CYP716A17、CYP716A44、CYP716A46、CYP716A52v2、CYP716A75、CYP716A78、CYP716A79、CYP716A80、CYP716A81、CYP716A83、CYP716A86、CYP716A154、CYP716A110、CYP716A140、CYP716A 141、CYP716A179、CYP716A252和CYP716A253；

细胞色素P450还原酶、C28氧化酶、C16氧化酶和C23氧化酶中的1、2、3种或全部是植物的，特别是拟南芥(Arabidopsis thaliana)、百脉根(Lotus japonicus)、积雪草(Centella asiatica)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、柴胡(Bupleurum falcatum)或披针形杜茎山(Maesa lanceolate)的；