[发明专利]用于制备类器官组合物的改进方法

说明书

本文公开了通过使肠内胚层单层聚集和培养所得肠内胚层聚集体的过程产生的类器官或其组合物。这些聚集的类器官的实例包含但不限于聚集的肝脏类器官、聚集的胃类器官、聚集的肠类器官和聚集的结肠类器官。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年8月13日提交的美国临时专利申请第62/885,903号的优先权的权益，所述美国临时专利申请特此通过引用整体明确并入本文。

技术领域

本公开的各方面总体上涉及类器官组合物和其制备方法，涉及前体细胞的聚集，例如在形成板中。

背景技术

人多能干细胞(hPSC；包含胚胎干细胞和诱导多能干细胞两者)表示用于生成人类3维胃肠组织(例如人肠类器官；HIO)的可再生资源，所述胃肠组织被组织成离散的上皮和间充质层。例如，在HIO中，上皮含有所有已知的肠上皮细胞类型，并且表现出功能性肠组织的若干种性质，包含吸收、肠激素合成和粘液分泌。在移植到实验动物模型之后，HIO经历了显著的生长和成熟，类似于含有粘膜、粘膜下层和固有肌层的出生后人类肠道。上皮细胞布置成隐窝-绒毛结构，在隐窝和成熟的上皮细胞中含有成体干细胞活性/祖区，具有如营养吸收和刷状缘酶活性等功能。因此，源自多能干细胞的类器官表示用于研究肠发育和疾病的生理相关且强大的工具，并且也为药物开发提供了新的平台。此外，鉴于诱导多能干细胞可以源自任何个体，包含那些患有肠疾病的个体，因此有可能产生疾病/患者特异性类器官，如用于个性化医疗应用的HIO。持续需要更接近体内组织的改进的类器官组合物以及制备更稳健、可扩展、更快和成本效益更高的类器官组合物的方法。

发明内容

本文公开了产生一个或多个聚集的类器官的方法。在一些实施例中，所述方法包括：将定形内胚层分化为肠内胚层单层和肠球状体；将所述肠内胚层单层与所述肠球状体分离；将所述肠内胚层单层解离成肠内胚层细胞的单细胞悬浮液；将所述肠内胚层细胞的单细胞悬浮液聚集成一个或多个肠内胚层聚集体；以及培养所述一个或多个肠内胚层聚集体以产生所述一个或多个聚集的类器官。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是粘附的，并且所述肠球状体被分离并悬浮在生长培养基中。在一些实施例中，所述定形内胚层已经从多能干细胞分化而来。在一些实施例中，所述定形内胚层已经从胚胎干细胞或诱导多能干细胞分化而来。在一些实施例中，所述定形内胚层是人定形内胚层。在一些实施例中，所述分离步骤包括从所述肠内胚层单层中抽吸所述生长培养基和悬浮的肠球状体。在一些实施例中，所述解离步骤包括使所述肠内胚层单层酶促解离。在一些实施例中，所述肠内胚层单层是用Accutase、Accumax、胰蛋白酶、胰蛋白酶/EDTA、胶原酶、分散酶、TrypLE Express或TrypLE Select或其任何组合酶促解离的。在一些实施例中，所述聚集步骤包括在悬滴中聚集所述单细胞悬浮液，在“v”或“u”底微孔培养板中使所述单细胞悬浮液离心，使用定轨振荡器聚集所述单细胞悬浮液，或在形成板中使所述单细胞悬浮液离心，或其任何组合。在一些实施例中，所述形成板是Aggrewell板。在一些实施例中，所述一个或多个肠内胚层聚集体中的每个肠内胚层聚集体包括约250、约500、约1000、约1500、约2000、约2500、约3000、约3500、约4000、约4500、约5000、约5500、约6000、约6500、约7000、约7500、约8000、约8500、约9000、约9500或约10000个肠内胚层细胞，或在由上述细胞数量中的任何两个所限定的范围内的任何数量的肠内胚层细胞。在一些实施例中，所述培养步骤包括使所述一个或多个肠内胚层聚集体与胞外基质或其模拟物或衍生物接触。在一些实施例中，所述胞外基质或其模拟物或衍生物包括基质胶(Matrigel)。