[发明专利]核苷酸序列的扩增方法和序列确定方法

权利要求书

1.扩增核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括下述工序(1)～(6)，

工序(1)：使第1正向引物在所述特定序列退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成在3’末端包含与所述相邻序列互补的序列的互补链，

工序(2)：在工序(1)中所得的互补链的3’末端以聚合的形式添加第1脱氧核苷酸，

工序(3)：在工序(2)中所添加的由第1脱氧核苷酸组成的多聚脱氧核苷酸链的3’末端进一步以聚合的形式添加第2脱氧核苷酸，

工序(4)：在工序(3)中所形成的单链DNA中的所述互补链的3’末端与所述多聚脱氧核苷酸链的结合部位，使第1反向引物退火，以该引物作为起点进行延伸反应，合成双链DNA，

工序(5)：以工序(4)中所合成的双链DNA作为模板，使用与所述特定序列互补的第2正向引物、和第1反向引物进行聚合酶链反应，

工序(6)：以工序(5)中所得的扩增产物作为模板，进一步使用与所述特定序列互补的第3正向引物、和第2反向引物进行聚合酶链反应，

第2正向引物位于特定序列中比第1正向引物更靠近相邻序列的位置，第3正向引物位于特定序列中比第2正向引物更靠近相邻序列的位置，

第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列和由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸的引物，

第2反向引物是在3’末端包含衔接子引物序列的引物，

第1～3脱氧核苷酸是从由脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和脱氧胸苷组成的4种脱氧核苷酸中分别选择的1种脱氧核苷酸，

第2脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸不同的脱氧核苷酸，并且

第3脱氧核苷酸是与第1脱氧核苷酸互补的脱氧核苷酸。

2.确定核苷酸链中的与特定序列相邻的序列的方法，该方法包括：

通过权利要求1所述的方法扩增所述相邻序列的工序，和

进行所扩增的相邻序列的测序分析的工序。

3.根据权利要求1或2所述的方法，第1反向引物是从5’末端起依次包含衔接子引物序列、由第3脱氧核苷酸组成的寡核苷酸、第4脱氧核苷酸和第5脱氧核苷酸的引物，

第4脱氧核苷酸是从除了第3脱氧核苷酸以外的3种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸，并且

第5脱氧核苷酸是从所述4种脱氧核苷酸中随机选择的脱氧核苷酸。

4.根据权利要求1～3中的任一项所述的方法，所述特定序列是来源于插入到DNA链中的外来基因的序列，所述相邻序列是与所述插入到DNA链中的外来基因插入物相邻的来源于宿主基因组的序列。

5.用于权利要求1～4中的任一项所述的方法的试剂盒，

该试剂盒包含第1正向引物、第2正向引物、第3正向引物、第1反向引物和第2反向引物。