[发明专利]合成抗凝血多糖的方法

权利要求书

1.一种酶促合成抗凝血剂N-、2-O、3-O、6-O硫酸化肝素前体硫酸酯(N，2，3，6-HS)产物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含N-脱乙酰肝素前体的起始多糖反应混合物；

(b)将所述起始多糖反应混合物与包含工程化氨基葡萄糖N-磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N-硫酸化肝素前体的第一产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

(c)将所述第一产物混合物与包含工程化己糖醛酸2-O磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N-、2-O硫酸化肝素前体硫酸酯(N，2-HS)产物的第二产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

(d)将所述第二产物混合物与包含工程化氨基葡萄糖6-O磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N-、2-O、6-O硫酸化肝素前体硫酸酯(N，2，6-HS)产物的第三产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

(e)将所述第三产物混合物与包含工程化氨基葡萄糖3-O磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N-、2-O、3-O、6-O硫酸化肝素前体硫酸酯(N，2，3，6-HS)产物的第四产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

其中所述工程化氨基葡萄糖N-磺基转移酶、己糖醛酸2-O磺基转移酶、氨基葡萄糖6-O磺基转移酶和氨基葡萄糖3-O磺基转移酶各自的生物活性包括与芳基硫酸酯化合物结合并且与其反应以将磺基转移到基于肝素前体的多糖上。

2.一种酶促合成抗凝血剂N-、2-O、3-O、6-O硫酸化肝素前体硫酸酯(N，2，3，6-HS)产物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供包含N-硫酸化肝素前体的起始多糖反应混合物；

(b)将所述起始多糖反应混合物与包含工程化己糖醛酸2-O磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N，2-HS产物的第一产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

(c)将所述第一产物混合物与包含工程化氨基葡萄糖6-O磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N，2，6-HS产物的第二产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

(d)将所述第二产物混合物与包含工程化氨基葡萄糖3-O磺基转移酶和磺基供体的反应混合物组合，以形成包含N-、2-O、3-O、6-O硫酸化肝素前体硫酸酯(N，2，3，6-HS)产物的第三产物混合物，所述磺基供体由芳基硫酸酯化合物组成；

其中工程化己糖醛酸2-O磺基转移酶、氨基葡萄糖6-O磺基转移酶和氨基葡萄糖3-O磺基转移酶各自的生物活性包括与芳基硫酸酯化合物结合并且与其反应以将磺基转移到基于肝素前体的多糖上。

3.根据权利要求2所述的方法，其中提供包含N-硫酸化肝素前体的起始多糖反应混合物的步骤还包括以下步骤：

(i)提供包含肝素前体的前体多糖组合物；

(ii)将所述前体多糖组合物与包含碱、优选氢氧化锂或氢氧化钠的反应混合物组合足以使所述肝素前体内的至少一个N-乙酰化氨基葡萄糖残基N-脱乙酰化以形成N-脱乙酰化肝素前体组合物的时间，优选足以形成N-脱乙酰化肝素前体组合物的时间，其中组合物中至少5％且至多60％、更优选至少12％且至多18％、甚至更优选15％的氨基葡萄糖残基保留N-乙酰化；和

(iii)将N-脱乙酰化肝素前体组合物与包含N-硫酸化剂、优选包含三氧化硫-三甲胺加合物的反应混合物组合，从而形成包含N-硫酸化肝素前体的起始多糖反应混合物。

4.根据权利要求3所述的方法，其中提供包含肝素前体的前体多糖组合物的步骤还包括将肝素前体从细菌或真核细胞培养物、优选细菌细胞培养物、更优选包含选自大肠杆菌K5菌株和大肠杆菌BL21菌株的细菌的细菌细胞培养物中分离的子步骤。

5.根据权利要求3所述的方法，其中所述N-脱乙酰化肝素前体组合物中N-脱乙酰化肝素前体的重均分子量是至少9000Da且小于或等于12500Da。