[发明专利]植物中CAST介导的DNA靶向

说明书

本公开涉及涉及使用CAST系统将所需序列靶向转座到植物基因组中的组合物和方法。若干实施方式涉及一种用于在植物染色体上产生巨基因座的方法，包括：(a)获得包含第一基因座的植物，其中所述第一基因座包含内源性状基因座或是转基因的；(b)向所述植物提供tnsB、tnsC、tniQ、Cas12k、向导核酸和供体盒；和(c)选择由步骤(b)产生的后代植物，其中所述供体盒的靶向转座发生在通过所述向导核酸靶向的第二基因座，其中所述第一和第二基因座遗传连锁但物理分离。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年8月7日提交的美国临时申请62/883,933的权益，其通过引用以其整体并入本文。

序列表的并入

于2020年8月5日创建的99,319字节(在中测量)的包含在名为“P34780WO00_SL.TXT”的文件中的序列表与本申请一起以电子方式提交并且通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开涉及组合物和方法，所述组合物和方法涉及使用CAST系统将所需序列靶向转座到植物基因组中。

背景技术

包含CRISPR相关蛋白(如Cas9和Cas12a)以及它们的向导RNA的系统已被用于通过产生靶向的双链断裂而在植物基因组中产生遗传多样性，所述双链断裂被植物的DNA修复机制不准确地修复，或通过与CRISPR相关蛋白、胞苷和腺嘌呤脱氨酶拴系通过靶向而不准确地修复。这些系统还已经用于通过同源重组或非同源末端连接促进供体DNA在CRISPR-产生的双链断裂的位点的靶向插入，然而，植物中CRISPR-介导的靶向DNA整合是低效的。由Tn7样转座酶亚基tnsB、tnsC和tniQ以及V-K型CRISPR效应子Cas12k组成的CRISPR相关转座酶(CAST)催化定点DNA转座。Cas12k与部分互补的非编码RNA种类、crRNA和tracrRNA形成复合物，并且由三部分组成的核糖核酸蛋白(RNP)复合物基于原型间隔区相邻基序(PAM)的存在和crRNA的可变部分与靶DNA之间的互补性来识别用于转座的染色体位点。相关的转座酶tnsB、tnsC和tniQ通过保守的“左端”(LE)和“右端”(RE)边界识别转座子，并且它们将其插入到通过Cas12k识别的靶序列附近的染色体位点中，优选在TA二核苷酸之间。已经证实在蓝细菌物种霍氏双岐藻(Scytonema hofmanni)(UTEX B 2349)和鱼腥蓝细菌(Anabaenacylindrica)(PCC 7122)中天然的两种同源CAST系统在大肠杆菌中具有转座功能(参见Strecker et al.,Science10.1126/science.aax9181,2019)。

需要在植物细胞中有功能的CAST系统以促进供体DNA在植物基因组中所需位置的有效靶向插入。

发明概述