[发明专利]新颖抗虫基因和使用方法

说明书

提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀有害生物活性的组合物和方法。提供了包含毒素多肽的编码序列的组合物。该等编码序列可用于DNA构建体或表达盒中，以用于在植物和细菌中进行转化和表达。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了分离的毒素核酸分子。另外，涵盖与多核苷酸对应的氨基酸序列，以及与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。特别地，本发明提供了分离的核酸分子，该等分离的核酸分子包含编码SEQ ID NO:19至SEQ ID NO:36中任一者所示的氨基酸序列的核苷酸序列，或者SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:18中任一者所示的核苷酸序列，以及其变体和片段。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀有害生物蛋白的新颖基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列可用于制备杀有害生物制剂和产生转基因抗害虫植物。

背景技术

植物害虫是世界重要农作物损失的主要因素。由于包括昆虫在内的非哺乳动物害虫的侵扰，仅在美国每年就损失约80亿美元。昆虫害虫主要通过密集施用化学杀有害生物剂来防治，所述化学杀有害生物剂通过抑制昆虫生长、阻止昆虫取食或繁殖或致死而有活性。因此可以实现良好的昆虫控制，但这些化学物质有时也可影响其它有益昆虫。化学杀有害生物剂的广泛使用导致的另一个问题是抗性昆虫品种的出现。这已经通过各种抗性管理实践得到了部分缓解，但是对替代害虫防治剂的需求日益增加。生物害虫防治剂，例如表达杀有害生物毒素如δ-内毒素的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株，也已施加至农作物，具有令人满意的结果，从而为化学杀有害生物剂提供了替代或补充。特别地，杀昆虫毒素(例如苏云金芽孢杆菌δ-内毒素)在转基因植物中的表达提供了针对选定的昆虫害虫的有效保护，并且表达此类毒素的转基因植物已经被商业化，从而允许农民减少化学昆虫防治剂的施加，

苏云金芽孢杆菌是一种革兰氏阳性芽孢形成土壤细菌，其特征是其能够产生结晶内含物，所述结晶内含物对某些昆虫目和昆虫物种特别有毒，但对植物和其它非靶向生物无害。为此原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀昆虫蛋白的组合物可用作环境可接受的杀昆虫剂以防治农业昆虫害虫或多种人类或动物疾病的昆虫媒介。

来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)对主要是鳞翅目、半翅目、双翅目和鞘翅目幼虫具有有效的杀昆虫活性。这些蛋白质还显示出针对膜翅目、同翅目、虱毛目、食毛目和蜱螨目害虫目以及其它无脊椎动物目(例如线形动物门、扁虫动物门和肉鞭毛虫门)的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree.在AdvancedEngineered Pesticides,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.中)。这些蛋白质最初主要基于它们的杀昆虫活性被分类为CryI至CryV。主要类别是鳞翅目特异性(I)、鳞翅目和双翅目特异性(II)、鞘翅目特异性(III)、双翅目特异性(IV)、以及线虫特异性(V)和(VI)。蛋白质被进一步分为亚科；每个家族中更高度相关的蛋白质被分配了门字母，例如Cry1A、Cry1B、Cry1C等。每个门内更密切相关的蛋白质被赋予名称，例如Cry1C1、Cry1C2等。

基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶标特异性描述了Cry基因的命名法(Crickmore等人，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:807-813)。在这种分类中，每种毒素都被分配了唯一的名称，包括一级等级(阿拉伯数字)、二级等级(大写字母)、三级等级(小写字母)和四级等级(另一个阿拉伯数字)。罗马数字已被替换为一级等级中的阿拉伯数字。序列同一性低于45％的蛋白质具有不同的一级等级，并且二级等级和三级等级的标准分别为78％和95％。

晶体蛋白在被摄入并溶解在昆虫中肠中之前不会表现出杀昆虫活性。摄入的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成活性有毒分子。(和Whiteley(1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。这种毒素与靶标幼虫的中肠中的顶端刷状缘受体结合，并插入顶端膜中，从而创建离子通道或孔隙，导致幼虫死亡。