[发明专利]分枝杆菌属物种的检测

权利要求书

1.一种用于检测样品中的所需分枝杆菌属物种的方法，所述方法包含以下步骤：

a)将分枝杆菌噬菌体偶联的顺磁粒子与所述样品在适合于准许所述分枝杆菌噬菌体与所述样品中存在的任何分枝杆菌噬菌体灵敏的分枝杆菌属物种结合的条件下混合，以形成反应混合物；

b)向所述样品施加磁场以收集和分离具有结合的所需分枝杆菌属物种的分枝杆菌噬菌体偶联的顺磁粒子；

c)在准许所述分枝杆菌属噬菌体在活分枝杆菌属物种细胞内复制且裂解所述活分枝杆菌属物种细胞的条件下，孵育具有结合的分枝杆菌属物种的所分离的顺磁粒子的悬浮液；

d)从所述孵育的悬浮液回收裂解的分枝杆菌属物种的核苷酸，任选地DNA；和

e)分析从所述裂解的分枝杆菌属物种释放的核苷酸，任选地DNA，以鉴定在所述所需分枝杆菌属物种中存在的标志核苷酸，任选地DNA序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤c)之前，洗涤收集的具有结合的分枝杆菌属物种的顺磁粒子以去除不是具有结合的所需分枝杆菌属物种的顺磁粒子的残余样品，且再悬浮于较小体积中。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中进行所述步骤c)孵育到细胞裂解终点。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在步骤c)中，在37℃下孵育具有结合的所需分枝杆菌属物种的所分离的顺磁粒子的所述悬浮液1到5小时，任选地约4小时，以准许分枝杆菌噬菌体在活分枝杆菌属物种细胞内复制且裂解所述活分枝杆菌属物种细胞。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述核苷酸是DNA；且步骤d)包含离心所述孵育的悬浮液以从所述孵育的悬浮液回收来自上清相的所需裂解的分枝杆菌属物种DNA。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤e)包含基于探针的qPCR。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中在步骤c)之后，使所述孵育的悬浮液经受热激条件。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述热激条件包括在40到70℃范围内的温度持续至少15秒到1分钟的时间段；任选地约55℃持续约1分钟，以确保从因内部分枝杆菌噬菌体作用而裂解或减弱的细胞最大释放分枝杆菌属物种核苷酸，任选地DNA。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述分枝杆菌噬菌体选自Barnyard分枝杆菌噬菌体、Black Raspberry分枝杆菌噬菌体、Bxz2分枝杆菌噬菌体、Che8分枝杆菌噬菌体、L5分枝杆菌噬菌体、Omega分枝杆菌噬菌体、PBI1分枝杆菌噬菌体、PG2分枝杆菌噬菌体、Rosebush分枝杆菌噬菌体、SB1分枝杆菌噬菌体、Cooper分枝杆菌噬菌体、Wildcat分枝杆菌噬菌体、TM4分枝杆菌噬菌体和D29分枝杆菌噬菌体；任选地D29分枝杆菌噬菌体。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述顺磁粒子的直径在0.25到1.5μm范围内；任选地约1μm。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述顺磁粒子选自MyOne 1μm甲苯磺酰基活化的戴诺珠粒、BcMag 1μm甲苯磺酰基活化的珠粒和羧基-阿德姆珠粒(300nm)；任选地BcMag 1μm甲苯磺酰基活化的珠粒。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中约5到25，任选地约10个分枝杆菌噬菌体与每一个顺磁粒子偶联。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中当所述样品为奶时，在所述步骤a)反应混合物中存在约0.5到3.5×10⁷个，任选地约2.5×10⁷个D29噬菌体涂布的珠粒。