[发明专利]由多能干细胞生产骨骼肌细胞和骨骼肌组织

权利要求书

1.一种从多能干细胞生产工程化骨骼肌组织的方法，包括以下步骤

(i)通过在基础培养基中培养多能干细胞来诱导所述多能干细胞的中胚层分化，所述基础培养基包含有效量的(a)FGF2、(b)GSK3抑制剂、(c)SMAD抑制剂和(d)无血清添加剂，所述无血清添加剂包括转铁蛋白、胰岛素、黄体酮、腐胺和硒或其生物可利用盐；

(ii)通过在包含有效量的(a)γ-分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)FGF2和(c)如(i)中无血清添加剂的基础培养基中，培养步骤(i)获得的细胞来诱导肌源性特化，然后

继续在所述培养基中培养，加入有效量的(d)HGF，然后

在包含有效量的(a)γ分泌酶/NOTCH抑制剂、(b)HGF、(c)如(i)中的无血清添加剂和(d)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养所述细胞；

(iii)通过在包含有效量的(a)HGF、(b)如(i)中的无血清添加剂和(c)敲除血清替代物(KSR)的基础培养基中培养步骤(ii)中获得的细胞，将所述细胞扩增和成熟为骨骼肌成肌细胞和卫星细胞；

(iv)通过在基础培养基中于机械刺激下培养步骤(iii)中获得的细胞，其分散在细胞外基质中，使所述细胞成熟为骨骼肌管和卫星细胞，所述基础培养基包含有效量的(a)如步骤(i)无血清添加剂，和(b)另外的无血清添加剂，包含白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺、硒或其生物可利用盐、L-肉碱、脂肪酸添加剂和三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)；

从而生产工程化骨骼肌组织。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述骨骼肌组织在100Hz的刺激下产生的收缩力为至少0.6毫牛顿(mN)，优选至少0.7mN，更优选至少0.8mN，更优选至少0.9mN，更优选至少1mN，更优选至少1.2mN，更优选至少1.3mN，更优选至少1.4mN，更优选至少1.5mN，更优选至少1.6mN，更优选至少1.7mN，更优选至少1.8mN，更优选至少1.9mN，并且最优选产生至少2mN。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多能干细胞来源于灵长类动物，特别是人类多能干细胞；和/或其中所述多能干细胞选自诱导多能干细胞、胚胎干细胞、孤雌生殖干细胞、通过细胞核移植生产的多能干细胞和通过化学重编程生产的多能细胞，特别是其中所述多能干细胞是诱导多能干细胞。

4.根据权利要求1-3中所述的方法，其中步骤(i)进行24至132小时，优选48至120小时，更优选60至114小时，甚至更优选72至108小时，更优选84至102小时，最优选约96小时。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中在步骤(i)中，所述GSK3抑制剂选自由CHIR99021、CHIR98014、SB216763、TWS119、tideglusib、SB415286、6-溴靛玉红-3-肟和丙戊酸盐组成的组，优选地其中所述GSK3抑制剂是CHIR99021；和/或

其中在步骤(i)中，所述SMAD抑制剂选自由LDN193189、K02288、LDN214117、ML347、LDN212854、DMH1组成的组，优选地其中所述SMAD抑制剂是LDN193189。