[发明专利]增加精细化学品生产中的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性

说明书

增加精细化学品生产中的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性。本发明的发明人已经发现增加cAMP水平和/或操纵PTS系统对宿主生物的精细化学品生产的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性的令人惊奇的积极作用。这通过缺失C‑端调节区去调节腺苷酸环化酶cyaa导致调节碳水化合物利用系统的cAMP水平增加或缺失Crr蛋白活性(碳水化合物阻抑抗性)而实现。二者导致增加的2‑岩藻糖基乳糖和6‑唾液酰乳糖生产(人乳寡糖)并增加碳水化合物使用。

本发明的发明人发现增加的cAMP水平对宿主生物的精细化学品生产的时空产率、碳转化效率和碳底物灵活性具有令人惊奇的积极作用。此外，发明人发现，不进行其内源调节及因此在cAMP生产中总是活性的腺苷酸环化酶活性有利于宿主生物的精细化学品生产的时空产率和碳底物灵活性。

此外，本发明的发明人还发现了降低crr基因或其变体的表达和/或Crr蛋白或其变体的失活或减少对于原核生物寡糖生产的碳转化效率、碳底物灵活性和时空产率的令人惊讶的作用。

Crr蛋白是微生物PTS碳水化合物利用系统的部分，其也与微生物细胞中的cAMP水平相关。

现有技术已知，降低PTS碳水化合物利用系统(PTS系统)的蛋白质表达对于除寡糖以外的某些化合物的生产有影响。

Flores等(Nature Biotechnology(1996),Volume 14,pages 620–623)描述了对在大肠杆菌中芳香族化合物生产的途径工程化。对参与大肠杆菌中芳香族化合物生产的途径的理论分析表明这种化合物的产量受限于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)可用性。这种化合物是一些生物合成途径中的主要组成部件之一，是PTS系统中用于葡萄糖内化的供体。从糖酵解途径1摩尔葡萄糖产生2分子PEP。然而，如果随后在葡萄糖转运期间PTS系统使用1mol的PEP，则每消耗1mol葡萄糖仅剩下1mol PEP可用于其它代谢反应。Flores等发现当缺乏ptsH、ptsI和crr基因的大肠杆菌菌株在发酵罐中在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基中培养时，两天后可以检测到异质的PTS-Glucose+回复体群。这些回复体能够通过GalP转运葡萄糖，并且在细胞质中，葡萄糖被葡萄糖激酶使用ATP磷酸化。

本发明的另一方面涉及不进行其内源调节的腺苷酸环化酶活性与crr基因或其变体的表达降低和/或Crr蛋白或其变体的失活或减少的组合，以及这种组合在一个宿主细胞内对原核宿主生物生产寡糖的碳转化效率、碳底物灵活性和时空产率的影响。

发明详述

时空产率被定义为单位时间内产物形成率。其可以是关于由其体积或重量定义的反应混合物或发酵物的空间或量。典型的定义包括重量，例如每单位时间(如小时)每体积(如升)或重量(如kg)发酵液生产的产物克数。

增加作为产物的给定精细化学品的时空产率是通过在给定反应空间中增加由其体积或重量定义的随时间的产物形成率来增加特定产物的生产率。在给定时期内，当时空产率增加时，在相同设置下会生产更大量的精细化学产物。当时空产率增加时，在给定的设置中在更短的时间内也可以生产同样数量的精细化学品。

碳转化效率被称为特定产物形成量与每消耗的碳源量的比率。其可以是关于摩尔比，例如每消耗1摩尔碳源产生的产物的摩尔数。碳转化效率也可以描述为最终分子中功能部分与每分子产物的比率。

在一个优选的定义中，根据本发明的碳转化效率被定义为在所述方法中使用的每碳源重量产生的特定产物的重量。这种计算可能是有利的，因为可以直接比较使用具有不同分子量的不同碳源的碳转化效率(例如麦芽糖、葡萄糖、甘露糖、甘油、蔗糖、葡萄糖酸盐)。

此外，精细化学品生产的碳转化效率通过本发明的方法和在本发明的宿主细胞中增加。使用cAMP增加的宿主细胞，提供给细胞的碳原子百分比增加被导入所需的精细化学产品中，因此由于不需要的副反应而损耗较少的碳或者通过细胞呼吸作用使较少的碳损耗为二氧化碳。在更加气候友好型经济的道路上，减少碳损耗为二氧化碳是所需的。