[发明专利]一种降低PCR非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用

说明书

本发明提供一种降低PCR非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用，所述的降低PCR非特异性扩增的核苷酸，包括序列A和序列B，所述序列A包括至少6个核苷酸，所述序列A中的核苷酸从A、T、C和G中选取三种碱基作为其构成；所述序列B包括至少4个核苷酸，所述序列B的核苷酸可为任意碱基，所述序列B可形成三维结构。本发明提供一种降低PCR非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增。

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种降低PCR非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用。

背景技术

聚合酶链式反应（PCR）技术是分子生物学的核心技术之一。从发明至今30年左右，基于PCR技术开发的新技术和新应用层出不穷，推动了生命科学领域的发展。然而，PCR扩增中非特异性产物的产生极大制约了PCR技术的检测信息通量，也限制了PCR技术进一步的应用开发。非特异性产物的产生通常是由于PCR体系内引物和引物之间、引物和非目标模板之间结合，进行非特异性扩增的结果。非特异性产物的产生消耗了体系中的底物，降低了特异性信号的强度，同时降低了检测结果的信噪比。

因此，亟需开发一种PCR扩增引物或探针，减少或消除PCR扩增过程存在的非特异性扩增这一行业难题。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种降低PCR非特异性扩增的核苷酸及其设计方法与应用，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增，如减少引物二聚体等。

本发明第一方面提供一种降低PCR非特异性扩增的核苷酸的设计方法，所述的降低PCR非特异性扩增的核苷酸，包括序列A和序列B，所述序列A包括至少6个核苷酸，所述序列A中的核苷酸从A、T、C和G中选取三种碱基作为其构成；所述序列B包括至少4个核苷酸，所述序列B的核苷酸可为任意碱基，所述序列B可形成三维结构。通过该技术参数的处理，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增。

优选地，对于如前所述的设计方法，还包括：将所述的降低PCR非特异性扩增的核苷酸进行预处理，所述预处理方法包括：将序列A和序列B连接后，得到组合核苷酸；将所述组合核苷酸加入到缓冲液中加热至65~85℃，保温5~10分钟，然后冷却至0~40℃，保温20~30分钟。通过该技术参数的处理，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增，如减少引物二聚体等。

优选地，对于如前所述的设计方法，还包括：所述缓冲液的组分为：300+±10 mMNaCl, 5±1 mM MgCl₂, 20±5 mM Tris (pH 7.6)。通过该技术参数的处理，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增，如减少引物二聚体等。

优选地，对于如前所述的设计方法，还包括：所述缓冲液包括0.001~0.003 μM的吡啶酮偶氮化合物。通过该技术参数的处理，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增，如减少引物二聚体等；可促进引物快速地进入聚合酶链式反应的稳定状态。

本发明第二方面提供一种根所述的设计方法制备得到的核苷酸。

本发明第三方面提供一种使用权利要求5所述的核苷酸在PCR扩增中的应用。

优选地，对于如前所述的应用，还包括：在所述PCR扩增中，使用DNA聚合酶和0.001~0.003 μM的吡啶酮偶氮化合物。通过该技术参数的处理，可在完成聚合酶链式反应，检测到目标基因序列，明显地控制住PCR扩增过程存在的非特异性扩增，如减少引物二聚体等；可促进引物快速地进入聚合酶链式反应的稳定状态。