[发明专利]高活性突变体构成的基因编辑工具及制备方法和修复先天性视网膜劈裂症致病基因的方法

说明书

本发明公开一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具及其制备方法以及用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症致病基因的方法，其特点是利用人类细胞进行体外定向进化筛选获得具有高活性的FnCpf1突变体Q125R，其表达载体为Addgene plasmids#69976；切割目标DNA的向导为crRNA，其表达载体pJET‑U6‑crRNAs；基因编辑用报告细胞系为293‑SC1和293‑RS1；mRS1基因同源重组修复模板为合成单链脱氧核糖核苷酸。该高活性FnCpf1突变体的获得包括建立FnCpf1突变体库、筛选具有高编辑活性低脱靶特点的突变体eaFnCpf1和利用eaFnCpf1对内源性基因进行编辑。该高活性突变体eaFnCpf1不仅具有较高的编辑活性，而且其可以识别更广范围的PAM，使得其在一定程度上丰富了基因编辑工具的“技能”，有助于扩大基因编辑在生物医学领域的应用。

技术领域

本发明涉及新型基因组编辑技术，在生命科学(含医学)具有广泛的应用前景，具体涉及一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具。本发明还涉及上述一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具的制备方法。本发明还涉及一种采用上述eaFnCpf1基因编辑器用于修复X连锁先天性视网膜劈裂症致病基因的方法。

背景技术

基因编辑技术是指利用基因编辑工具对特定基因进行目的性修饰。目前，基因编辑工具主要有锌指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)、转录激活子样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和规律成簇间隔短回文重复Cas蛋白核酸内切酶系统(clustered regulatory interspaced short palindromicrepeat(CRISPR)/Cas-based RNA-guided DNA endonuclease)。该系统作为细菌和古细菌长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御体系，通过将入侵者DNA整合到间隔序列中形成免疫记忆，利用CRISPR RNAs(crRNAs)靶向引导Cas蛋白对同源序列DNA进行切割和修饰。其中，II型的组成较为简单，仅Cas蛋白以及向导RNA(guidanceRNA)。目前应用较广泛的有CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a(包括FnCpf1)，相比于CRISPR-Cas9，Cpf1有蛋白结构简单、分子量较小和单链crRNA短的优点。FnCpf1识别的PAM序列是5’-KYTV-3’(Y是T或C，V是A、C或G)，较之其他更为灵活，弥补了Cas9只能靶向富含嘌呤的PAM序列，大大扩宽了基因编辑工具的靶向范围。但是，在某些位点上，Cpf1的编辑效率和对PAM的选择范围尚不能中分满足科研工作的需要。

已经有相关研究经优化得到AsCpf1突变体，RR变异体(S542R/K607R)和RVR变异体(S542R/K548V/N552R)，它们识别PAM 5’-TATV-3”和5’-TYCV-3”。在理论上，FnCpf1的编码序列的进化可以调整基因组编辑活性和保真性。因此，我们试图设计用人类细胞定向进化FnCpf1，以获得活性更高的FnCpf1突变体，从而应用于人类基因工程的研究和疾病治疗的临床应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种在人类细胞中具有增强活性的基因编辑工具eaFnCpf1，利用其高活性、高保真性和更灵活的PAM识别性拓宽基因编辑技术的应用范围。

为此，本发明提供的一种在人类细胞中具有高活性的FnCpf1突变体构成的eaFnCpf1基因编辑工具，突变体为Q125R，编码ATG的第一个氨基酸定义为1号氨基酸残基，在人源细胞中具有较FnCpf1更高的DNA切割活性和低脱靶率，被优化的底物为野生型FnCpf1，其表达载体为Addgene plasmids#69976；切割目标DNA的向导为crRNA，其表达载体为pJET-U6-crRNAs；基因突变方法为利用安捷伦诱变试剂盒靶向性突变目的片段；基因编辑用报告细胞系为293-SC1和293-RS1；mRS1基因同源重组修复模板为合成单链脱氧核糖核苷酸。