[发明专利]一种双sgRNA结合RecET系统敲除盐单胞菌DNA大片段的方法

说明书

本发明公开了一种双sgRNA结合RecET系统敲除盐单胞菌DNA大片段的方法。本发明公开的敲除盐单胞菌DNA大片段的方法中，所敲除DNA大片段大于等于10kb，该方法包括：将具有如下1)‑4)特征的重组载体导入出发盐单胞菌中，实现DNA大片段的敲除；1)能转录sgRNA1与sgRNA2，sgRNA1与sgRNA2分别靶向所敲除DNA大片段的两端；2)含有出发盐单胞菌中所敲除DNA大片段的上游同源臂和下游同源臂；3)能表达Cas9；4)能表达RecE蛋白质和RecT蛋白质。本发明解决了目前盐单胞菌中无法实验大片段DNA敲除的问题，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种双sgRNA结合RecET系统敲除盐单胞菌DNA大片段的方法。

背景技术

盐单胞菌(Halomonas bluephagenesis)TD1.0具有对“盐”和“碱”这两种极端条件的天然适应能力，可实现无灭菌开放式连续发酵，已作为低成本工业发酵菌株用于多种生物制品的合成。作为一株重要的工业生产平台菌株，需要对其进行高效的基因编辑，如DNA大片段的删减。随着CRISPR/Cas9新一代基因编辑技术的快速发展，来自酿脓链球菌的II-A型CRISPR-Cas系统已经在原核生物和真核生物中得到了广泛的应用。该系统实现干扰过程的效应复合物由crRNA、tracrRNA和具有多功能结构域的Cas9蛋白组成。目前的实际应用中，crRNA已与tracrRNA融合为一条链，被称为sgRNA，包含20个能与靶标DNA发生碱基互补的碱基序列和一个能与Cas9结合的RNA二级结构。Cas9蛋白含有HNH结构域和RuvC结构域，都具有核酸酶活性，分别切割靶标DNA中与crRNA互补的靶标链和被crRNA替换的非靶标链。

前期研究已经利用酿脓链球菌的CRISPR-Cas9系统，在盐单胞菌中初步建立了基因编辑工具。该工具由双质粒系统组成：Cas9表达载体及sgRNA的表达载体(Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.,Yang,T.,Yin,J.,Guo,Y.,et al.(2018).Crispr/cas9 editing genome ofextremophile halomonas spp.Metabolic Engineering,S1096717618300053.)(另见中国专利申请“一种在盐单胞菌中快速基因编辑的载体组合及其应用”，申请号201711445256.3)。该方法的测试结果显示，随着DNA片段长度增加，其敲除成功率明显降低，最多能实现约3kb DNA片段的敲除，且其敲除成功率仅为25％，这一方法不能实现该菌的DNA大片段删减。并且在该研究中还测试了λ-Red重组系统在盐单胞菌中是否能够提高CRISPR-Cas9基因编辑的效率，结果发现λ-Red重组系统的表达对细胞造成了毒性，使菌体生长受到严重抑制，敲除成功率为0。目前急需探索一种可以敲除大片段的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何有效敲除盐单胞菌的DNA大片段。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种敲除盐单胞菌DNA大片段的方法(记为方法1)，所述DNA大片段大于等于10kb，所述方法1包括：将具有如下1)-4)特征的重组载体导入出发盐单胞菌中，实现所述DNA大片段的敲除；

1)能转录sgRNA1与sgRNA2，所述sgRNA1与所述sgRNA2分别靶向所述DNA大片段的两端；

2)含有出发盐单胞菌中所述DNA大片段的上游同源臂和下游同源臂；

3)能表达Cas9；

4)能表达RecE蛋白质和RecT蛋白质。

上述方法1中，所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度均可大于等于1000bp。所述上游同源臂和所述下游同源臂的长度均可为1000bp。

上述方法1中，所述重组载体可为两个、一个、三个或四个重组载体。