[发明专利]一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法

说明书

本发明涉及生物化工技术领域，尤其是一种萃取‑反萃取分离纯化surfactin方法，利用surfactin发酵液的酸沉物，加入醇溶液振荡或超声10min后，过滤，得醇过滤液；醇过滤液与正己烷、乙酸乙酯、水构建萃取体系a，调pH为1.5‑4萃取，分层，取上层有机相；另将正己烷、乙酸乙酯、水和醇混合构建萃取体系b，静置分层，取下层，获得萃取体系b下层水相；将上层有机相与萃取体系b下层水相按体积比1:1混合，调节pH为7‑8，振荡，静置分层，取下层水相冷冻干燥后，即得surfactin纯化物，充分利用了surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，使得纯化物中，surfactin含量≥65％。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其是一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法。

背景技术

Surfactin是由7个氨基酸残基组成的环肽和13-15个碳原子链长的β-羟基脂肪酸酯化而成，于1968年被Arima等首次从枯草芽孢杆菌中分离出来。经研究表面：Surfactin在抗菌、抗病毒、抗癌、溶血栓等方面表面出极好的生物活性，在化妆品、医药、食品、乳化剂、保湿剂、精细化工等行业具有广泛的应用前景。可是，目前市场上Surfactin的商品价格昂贵，Surfactin标准品的价格超过200元/mg，究其原因，主要体现在：①现有Surfactin生产主要依靠生物发酵，发酵生产的产量极低，致使生物发酵产物中的Surfactin含量低，维持在mg-g/L的水准；②Surfactin为小分子脂肽化合物，与培养基的杂质成分类似，分离纯化困难。

经查阅相关研究文献，发现有许多集中在环脂抗菌肽分离提纯的研究，但是未注重对分离物中Surfactin的含量提升，以便于后续进一步精制研究，例如：刘佳欣等.枯草芽孢杆菌HS-A38产抗菌脂肽Bacillomycin D的组分分析与鉴定[J].工业微生物，2017年04月，第47卷第2期，公开了将HS-A38发酵液离心分离上清液，酸沉淀、醇抽提、甲醇溶液减压旋蒸，获得固态粗提物，得出粗提物棕黄色粉末，产率1.956g/L，然而，该研究并未公开最终提取物surfactin的含量。再例如：林青荣.枯草芽孢杆菌脂肽类物质的分离纯化鉴定与应用研究[D].山西大学，2012：12-15，公开了将发酵液在8000r/min条件下离心20min除去菌体，得到上清液，再从上清液中提取脂肽类物质：①甲醇直接抽提，静置12h；②乙醇直接抽提，静置12h(同甲醇，)；③6mol/L盐酸调pH沉淀，离心收集沉淀，除去水分，加入甲醇萃取，搅拌，滤去沉淀，得甲醇提取液；④6mol/L盐酸调pH沉淀，离心收集沉淀，除去水分，加入乙醇抽提沉淀。再将①、②、③、④处理中所得的溶液加入适量蒸馏水，调整pH至7.0,50℃旋转蒸发除去有机溶剂，得到黄色粉末样品，采用正己烷洗涤三次，除去游离脂肪酸，得样品；得出：第③组提取脂肽获得量达到最优，利用标样，HPLC测定脂肽提取的平均回收率为91.65％，该研究也未公开提取物中surfactin的含量。

除上述缺陷之外，现有研究中的分离提纯手段，主要采用的是：酸沉淀、吸附分离、膜过滤、絮凝、色谱分离等，但这些分离纯化方法存在着诸多问题：①所得产品中Surfactin含量不高，例如酸沉淀；②所得产品的成本高昂，工艺要求高，例如：膜过滤、超滤等；③仅适用于试验室小批量生产，不适合大规模工业化操作，例如色谱分离；④带来新的杂质，影响后续精制工艺，例如絮凝，带入絮凝剂杂质等。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种萃取-反萃取分离纯化surfactin方法，利用surfactin酸性条件下不溶于水，但易溶于复配有机溶剂，且中性条件下易溶于水，但不溶于复配有机溶剂的特性，实现萃取-反萃取工艺分离纯化surfactin，此发明适宜工业化纯化surfactin，为后面进一步精制surfactin提供条件，步骤简单，耗能低，设备要求低，且降低废液排放量，不消耗大量酸碱，可实现有机溶剂循环利用，降低surfactin产品分离纯化成本。

具体是通过以下技术方案得以实现的：