[发明专利]一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法

说明书

本发明公开了一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法。本发明提供鉴别待测小麦是否为单倍体小麦的方法，为检测待测小麦的基因组DNA中是否含有bar基因和/或Cas9基因；如果待测小麦的基因组DNA中不含有bar基因和Cas9基因，则所述待测小麦为单倍体小麦或候选为单倍体小麦；如果待测小麦的基因组DNA中含有bar基因和/或Cas9基因，则所述待测小麦为非单倍体小麦或候选为非单倍体小麦。本发明所提供的方法可用于小麦TaMTL纯合敲除突变体作为父本与其他小麦材料杂交诱导的单倍体的快速鉴定，对小麦单倍体育种、DH群体构建、基因定位和目标基因功能研究等具有重要意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过小麦TaMTL基因敲除突变体诱导的小麦单倍体植株筛选方法。

背景技术

小麦是三大主粮作物之一，为人类提供了约20％的卡路里。随着人口增加和社会发展，人们对粮食产量和优质专用的需求越来越高。因此，培育高产、优质、抗病的小麦新品种尤为重要。传统育种中育成一个优良小麦品种至少需要6～7年，而单倍体育种采用孤雌生殖或雄核发育产生单倍体，经过加倍后直接产生纯合双单倍体，经过一次培养或诱导就能产生全部基因同质的纯合二倍体纯系，繁殖种子后就可参加产量鉴定和适应性试验，大大缩短了育种进程，提高了育种效率。

小麦单倍体植株最早是通过花药离体培养获得的，之后研究学者逐步建立了一些新的单倍体诱导方法，如小孢子培养、异源种属花粉诱导(包括玉米、高粱、珍珠稷、大麦等)、物理辐射和化学试剂处理诱导、延迟授粉诱导等。在玉米中发现，被称为单倍体诱导系的Stock 6作为父本可诱导母本产生2.0～3.0％的单倍体种子。随后培育了WS14、MHI、RWS、PHI、BHI306和CAU5等优良单倍体诱导系，玉米单倍体植株诱导率达8.0～16.0％。进一步通过精细定位、基因组测序和遗传互补等方法，证明玉米中的单倍体诱导是由于精子细胞质特异性磷脂酶MTL编码基因的移码突变导致，并克隆了玉米ZmMTL(ZmPLA1)基因,发现该基因在水稻、小麦、大麦等作物中具有高度保守性。

与此同时，以CRISPR/Cas9为代表的基因编辑技术迅速发展，并在植物中得到了广泛应用。利用CRISPR/Cas9技术敲除玉米ZmPLA1基因，敲除植株自交或作为父本与其他自交系杂交，单倍体诱导率2.0-6.7％。采用胚特异型启动子ZmESP和胚乳特异性启动子HvASP，构建胚特异表达绿色荧光蛋白(eGFP)和胚乳特异表达红色荧光蛋白(DsRED)的双荧光单倍体筛选与标记鉴定系统，获得的诱导系能够高效诱导单倍体，平均诱导率7.5％。针对水稻中ZmMTL基因的同源基因OsMTL，设计CRISPR/Cas9基因编辑的靶点gRNA进行突变，自交后代中平均单倍体诱导率为6.0％左右。最新研究表明，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小麦中ZmMTL的同源基因TaPLA-4A和TaPLA-4B，单倍体诱导率2～3％(Liu et al.，PlantBiotechnology Journal，2020，18：316-318)。在优化小麦CRISPR/Cas9编辑系统的基础上，利用小麦TaU6启动子和双靶点策略对小麦中ZmMTL的3个同源基因TaMTL-4A、TaMTL-4B、TaMTL-4D同时进行敲除，发现TaMTL-4A和TaMTL-4D发生突变时的单倍体诱导率为10％左右，TaMTL-4A、TaMTL-4B、TaMTL-4D同时发生突变时的单倍体诱导率为11.8～31.6％，并首次在禾谷类作物中发现了无胚型和胚及胚乳双无型籽粒(Liu et al.，Journal ofExperimental Botany，2020，71：1337-1349)。