[发明专利]罗非鱼体外免疫抑制模型及其构建方法

说明书

本发明公开了罗非鱼体外免疫抑制模型及其构建方法，所述方法采用环磷酰胺诱导罗非鱼体外免疫细胞，环磷酰胺的浓度在50mM以内。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明首次采用环磷酰胺诱导罗非鱼体外免疫抑制模型，为研究鱼类靶向药物，专一性的给予靶向治疗，调节鱼类免疫功能有十分重要的意义；(2)所述方法采用环磷酰胺作用于罗非鱼体外免疫细胞，优化了使用剂量和作用时间，避免出现亢进模型，确保获得100％的免疫抑制模型。

技术领域

本发明属于水产养殖技术领域，涉及一种细胞模型的制备，具体为罗非鱼体外免疫抑制模型及其构建方法。

背景技术

免疫系统是机体抵御细菌、病毒感染的重要防线，而自身免疫功能的抑制或降低使鱼体产生病理性的细胞信号转导通路改变，导致机体免疫应答能力下降，对疾病敏感性增强，抵抗力减弱，且会诱发其他疾病的发生、导致发病率和死亡率的大幅上升。因此，利用环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)诱导罗非鱼免疫抑制并构建模型，对于研发靶向药物，专一性的给予靶向治疗，调节鱼类免疫功能有十分重要的意义。

CTX是已知的最强的烷化剂类免疫抑制剂，作用强而持久，临床已有不少应用，但是CTX作用于机体的机制是相当复杂的，往往不同剂量，不同作用时间，会引起机体免疫抑制和亢进两种不同结果，免疫抑制机制目前尚不十分清楚。CTX作为免疫抑制剂被广泛运用在动物,主要集中在猪、鸡和小鼠上，而罗非鱼等水产动物未见相关报道。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，获得一种通过环磷酰胺诱导罗非鱼体外免疫抑制模型的方法，本发明提供了罗非鱼体外免疫抑制模型及其构建方法。

技术方案：罗非鱼体外免疫抑制模型的构建方法，所述方法采用环磷酰胺诱导罗非鱼体外免疫细胞，环磷酰胺的浓度在50mM以内。

优选的，环磷酰胺的浓度为40mM。

优选的，所述方法具体为：分离罗非鱼的免疫细胞后预培，然后移除培养上清，换用含环磷酰胺的L-15培养基继续培养，弃上清测定免疫细胞的增殖活性，并同时测定部分免疫细胞中的一氧化氮和超氧阴离子含量。

优选的，所述免疫细胞为头肾巨噬细胞、外周血白细胞和脾细胞；其中所述的部分免疫细胞为头肾巨噬细胞和脾细胞。

优选的，头肾巨噬细胞的分离方法如下：随机抽取罗非鱼，MS-222(间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐)麻醉后，采血，在无菌的条件下，剖取罗非鱼头肾，并研磨，研磨液通过100目尼龙网，滤过液加入到34％/51％的Percoll(多用途密度梯度分离液)分离液的液面上，4℃，350g离心25min，得液面交界处的巨噬细胞。

优选的，外周血白细胞的分离方法如下：随机抽取罗非鱼，MS-222麻醉后，用0.1％KMnO₄进行体表消毒后再用75％酒精棉球擦洗；在无菌的条件下进行尾静脉抽血，全血与0.1％FCS-L-15培养基按1/1比例稀释后加入到已盛有60％的Percol1分离液的离心管中，4℃，350g离心15min，得60％液面交界处的白细胞。

优选的，脾细胞分离方法如下：随机抽取罗非鱼，MS-222麻醉后，用0.1％KMnO₄进行体表消毒后再用75％酒精棉球擦洗；在无菌的条件下，剖取罗非鱼脾脏，加入PBS研磨，然后加入5倍体积的PBS，1500g离心10min，弃上清；加入5-10倍细胞体积的红细胞裂解液重悬细胞后，室温静置5min，1500g离心5min，弃上清，PBS洗涤3次，5％FCS-L-15重悬细胞。

优选的，罗非鱼体重为150±5g；罗非鱼的饲养条件为27±2℃，pH6.8-7.6，DO5mg/L，NH₃0.05mg/L，H₂S0.01mg/L；每天投喂量为鱼体质量的2％。