[发明专利]用于检测禽偏肺病毒的引物、试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提供了用于检测禽偏肺病毒的引物，其通过特异性扩增C型禽偏肺病毒的N基因进行禽偏肺病毒的核酸检测。本发明还提供了禽偏肺病毒检测试剂盒，其通过RT‑PCR扩增、纳米金示踪，双重放大信号，并实现检测结果的可视化，用于禽偏肺病毒检测能够大幅降低检测下限，同时有效提高病毒检测的特异性、灵敏性、准确性和可重复性。使用本发明试剂盒检测病毒，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及禽偏肺病毒的核酸检测及其应用。

背景技术

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)于1978年首次在南非报道。aMPV能够在火鸡和鸡等禽类中引起急性的、高传染性的上呼吸道感染以及产蛋的下降。我国于1999年首次分离并报道了该病毒，从而证实了我国也有aMPV的发生。在我国多个省地区的地方品种种鸡场进行流行病学调查过程中，发现aMPV感染率有的可高达100％。

禽偏肺病毒属于副黏病毒科、肺病毒亚科中的偏肺病毒属，为不分节段单股负链的RNA病毒，长约14kb，由8个基因组成，主要编码8种结构蛋白，依次为核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、第二基质蛋白(M2)、小疏水蛋白(SH)、表面糖蛋白(G)和RNA聚合酶(L)。G蛋白是所有病毒蛋白中最不保守的蛋白，根据G基因核苷酸序列的多变性，把禽偏肺病毒分为A、B、C、D四个亚型。核苷酸序列分析显示，在美国发现的C型禽偏肺病毒毒株有90％同源性，但是与A和B型只有40-70％的同源性。与其它三种亚型相比，C型禽偏肺病毒在系统进化发育上与同属的人偏肺病毒更为接近。C型禽偏肺病毒感染在美国、法国以及韩国有报道，2012年我国东南部首次发现鸡C型禽偏肺病毒感染。

在禽偏肺病毒核酸检测方面，国际动物卫生组织使用的检测手段目前有RT-PCR方法，实验室还可以通过实时荧光定量逆转录PCR(realtime RT-PCR)、荧光环介导逆转录等温扩增(RT-LAMP)技术进行病原鉴定，这些方法的检测最低核酸浓度一般不能低于1800拷贝数/μl，对于禽偏肺病毒病的检出以及防控具有较大限制。提高病毒检测的灵敏性，同时提高病毒检测的稳定性是当前亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏性高、稳定性强的禽偏肺病毒检测试剂盒，尤其是C型禽偏肺病毒检测试剂盒。

本发明首先提供用于检测禽偏肺病毒的一对特异性引物，其核苷酸序列为：

上游引物：ATGTCTCTTCAGGGGATTCAGCTC；

下游引物：CTGCATTACTCCTTCAGCTGCATGTGAG。

本发明提供了所述特异性引物对在制备禽偏肺病毒检测试剂盒或检测试剂中的应用。

进一步，本发明提供了含有所述特异性引物对的禽偏肺病毒检测试剂盒。

所述禽偏肺病毒检测试剂盒优选为核酸胶体金检测试剂盒，其包括核酸扩增体系和检测卡，所述核酸扩增体系包括所述引物对，所述引物对中一条引物的5’端标记有生物素，另一条引物的5’端标记有异硫氰酸荧光素(FITC)，所述检测卡包括按顺序依次连接的样品垫、结合垫、反应膜和吸水垫，所述结合垫含有纳米金标记的亲和素，所述反应膜上设置有检测线和质控线，所述检测线包被有抗FITC单克隆抗体，所述质控线包被有生物素。

所述亲和素的用量优选为0.3-0.5mg，进一步优选为0.4mg。

所述检测线优选用1.0-1.2mg抗FITC单克隆抗体进行包被。

所述质控线优选用1.0-1.2mg生物素进行包被。

所述核酸扩增体系还包括缓冲液、dNTP混合物、反转录酶、DNA聚合酶、无RNA酶的水。