[发明专利]一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用

权利要求书

1.一种卤化酶重组表达载体制备方法，其特征是：所述卤化酶序列如SEQ ID NO.1所示，包含以下步骤：

1）.根据链霉菌Streptomyces 31-2基因组测序结果设计编码基因的完全编码区扩增引物，Halo编码基因上下游引物分别加入了限制性内切酶BglⅡ和HindIII 识别位点，引物HaloER的序列为：5'-CCCAAGCTTCGGCATGGCGGTCTTCATGT-3'，引物HaloEF的序列为：5'-GGAAGATCTATGGACACGACAGACACAGGCG-3'；

2）.HaloEF/ER卤化酶特异引物以Streptomyces sp. FJS31-2基因组DNA为模板扩增，PCR产物纯化，TA克隆，通用引物M13F/M13R进行PCR验证，测序验证阳性克隆，菌株Halo-T用限制性酶BglⅡ和HindⅢ双酶切，双酶切片段连接相应酶切并去磷酸化处理的表达载体pET-32a，室温反应6 h，转化JM109感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定及质粒酶切鉴定，测序鉴定，得到原核表达质粒载体pET-halo；最后得到阳性克隆菌质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定，确定阳性克隆菌；

3）.取阳性克隆菌pET-halo的质粒和pET32a 质粒100 ng，转化大肠杆菌BL21（DE3）Rosetta感受态细胞，转化子过夜培养、T7 启动子引物菌液PCR 鉴定后，得到重组质粒的基因工程菌pET-haloBL21和pET32aBL21；

4）.取前述2种基因工程菌各50 μL，分别接种于5 mL浓度为100ng/μL 氨苄西林的LB液体培养基中220 r/min，37℃培养3 h 后分别接种100 mL浓度为100 ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220 r/min，37℃ 培养至OD600=0.3 时，取5 mL 上述培养物分装至50mL 无菌离心管，加入终浓度为1.0mmol/L 的IPTG， 置于恒温摇床诱导6 h；取1 mL 诱导后培养物，4000 r/min 离心5 min，菌体沉淀加入100 μL 的5×SDS-PAGE 电泳上样缓冲液，置于99℃金属浴中裂解10 min，12000 r/min，室温离心10 min，上清液即为菌体总蛋白裂解液；

5）.分别取10 μL 总蛋白裂解液上样，10% 的SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝R250 染色6 h 后，甲醇-冰醋酸脱色液脱色6 h，结果显示为目标卤化酶蛋白。