[发明专利]血管紧张素1型受体稳定表达细胞株

说明书

本发明涉及表达血管紧张素1型受体的重组表达载体、表达系统，以及具有该重组表达载体或表达系统的细胞。本发明提供的血管紧张素1型受体稳定表达细胞株利用基因编辑法将目的基因稳定敲入到细胞基因组中，可很稳定地随着细胞复制而复制，不会出现在细胞株传代而丢失的情况，可以用于以血管紧张素1型受体为靶点的药物开发和功能检测。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及血管紧张素1型受体稳定表达细胞株。

背景技术

血管紧张素1型受体(Angiotensin type 1 receptor，AT1R)是GPCRs超家族A组成员，是肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)中重要的组成部分，与机体血压调节、水盐代谢平衡有直接的调节作用，内环境的稳态中扮演着重要的作用，其过度激活是高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的主要诱因。因此，血管紧张素1型受体是心脑血管疾病药物开发的明星靶点，包括小分子药物、单克隆抗体药物等。

血管紧张素1型受体为靶点的药物开发，在先到化合物筛选过程中，以及要针对血管紧张素1型受体进行相关功能的验证中，目前主要还是用瞬时表达的方式进行，也有以稳定细胞株做相关的检测，但受体表达不稳定、不容易检测，效果非常不好。

血管紧张素1型受体药物开发在细胞水平做检测主要是两种方法，一是瞬时转染；二是构建稳定表达细胞株。瞬时转染的方法效率低、批次间差异大、成本高等，严重影响实验的进程。现有的血管紧张素1型受体稳定表达细胞株是使用传统的随机整合的方法构建，表达不够稳定，随着细胞的传达，目的基因容易丢失，影响实验开展；而且由于受体上不带合适的检测标签，导致细胞株在使用上受到很大的限制。

发明内容

本发明第一方面提供表达血管紧张素1型受体的重组表达载体。

本发明提供的重组表达载体是在pAAVS1-Puro-DNR表达载体中插入了编码人源血管紧张素1型受体的核苷酸序列而获得的。

本发明提供的表达载体可以确保将目的基因(即编码人源血管紧张素1型受体的基因)稳定敲入宿主细胞。

在一些实施方式中，所述编码人源血管紧张素1型受体的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。

在一些实施方式中，在pAAVS1-Puro-DNR表达载体中还插入了信号肽序列。作为一种具体的实施方案，所述信号肽序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过在载体中插入信号肽，可以确保表达得到的受体高效转移到细胞膜上。

在一些实施方式中，在pAAVS1-Puro-DNR表达载体中还插入了编码蛋白标签的核苷酸序列。

在一些实施方式中，所述蛋白标签选自Flag标签、Halo标签、SNAP标签、His6标签、eGFP标签、eYFP标签、eCFP标签中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述蛋白标签包括Flag标签。作为一种具体的实施方案，编码所述Flag标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明通过表达flag标签，可以方便进行受体进行细胞膜表达检测以及其他可利用flag标签开展相关研究。

在一些实施方式中，所述蛋白标签包括Halo标签。作为一种具体的实施方案，编码所述Halo标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。本发明通过表达halo标签，可确保表达产物直接被halo荧光底物所标记，方便受体开展利用halo标签的相关研究。

在一些实施方式中，所述重组表达载体为pAAVS1-Puro-DNR-flag-halo-AT1R，具有如图1所示的图谱。

本发明第二方面提供表达血管紧张素1型受体的CRISPR-Cas9表达系统，所述表达系统中包含第一方面所述的重组表达载体。