[发明专利]一种鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法及应用

权利要求书

1.一种鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括鱼类肠道上皮细胞原代、传代培养与鉴定：

(1)原代培养：将鱼肠道组织进行无菌处理及机械剪碎、消化获得细胞组织沉淀，加入原代细胞培养液培养原代细胞；

(2)传代培养：细胞进行传代至第1-5代时，传代细胞消化时使用的细胞消化液为0.05vol％的胰蛋白酶温和性消化液，细胞培养液中的表皮细胞生长因子浓度为10ug/ml，细胞培养液实行半换液方式；传代至5-10代时，使用的细胞消化液为0.05vol％的胰蛋白酶温和性消化液，培养液中的表皮细胞生长因子浓度为5ug/ml，细胞培养液实行1/3培养液换液；10代以后传代细胞使用的细胞消化液为0.25vol％的胰蛋白酶消化液，实行全部换液模式，细胞培养液中的表皮细胞生长因子浓度为5ug/ml；

(3)鉴定：通过细胞免疫荧光技术鉴定鱼肠道上皮细胞。

2.根据权利要求1所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述鱼为淡水鱼，例如草鱼、鲤鱼、鲫鱼、胖头鱼或鳊鱼；优选地，所述鱼选取25g/尾的1龄健康草鱼。

3.根据权利要求1所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中无菌处理的方法为将肠道放于含有6ml D-PBS且加入2％双抗的直径为10cm的培养皿里面保持组织活性，再利用剪刀与镊子剔除草鱼肠道外面的一层脂肪后剪成前、中、后三段且把小肠纵向剪开，然后放入新的含有D-PBS的直径为10cm的培养皿里面进行清洗，重复清洗后放入含75％酒精的培养皿中清洗杀菌处理，然后马上用镊子夹到含有D-PBS的培养皿里面进行漂洗去掉酒精，重复漂洗后将三段肠道分别放入三个无菌的EP管中，其中，所述双抗为青霉素200，000IU/l和链霉素200mg/l。

4.根据权利要求1所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述步骤(1)中机械剪碎、消化获得细胞组织沉淀，加入原代细胞培养液培养原代细胞的方法为：将无菌处理后的草鱼肠道组织用剪刀剪碎后加0.05vol％的胰蛋白酶温和性消化液消化5min，加含FBS培养基终止消化反应后，离心去掉上清液，获得组织细胞沉淀后加入100ul胎牛血清重悬沉淀后铺6孔板细胞培养板，待组织细胞28℃、5％CO₂贴壁培养1h后轻轻加入1ml原代细胞培养液进行培养，每隔2天换一半的细胞培养液进行培养。

5.根据权利要求1所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述原代细胞培养液和传代细胞培养液采用的基础培养基均为DMEM培养基。

6.根据权利要求5所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述原代细胞培养液和传代细胞培养液的基础培养基DMEM中加入了10vol％的胎牛血清、1vol％的丙酮酸钠、1vol％的非必需氨基酸、1vol％的L-谷氨酰胺、0.1vol％的β-巯基乙醇和1vol％双抗，所述双抗为青霉素100，000IU/l和链霉素100mg/l。

7.根据权利要求1所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述传代培养是加入原代细胞培养液培养原代细胞到第9天后开始进行传代培养。

8.根据权利要求1所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法，其特征在于，所述细胞免疫荧光技术为：选取肠道上皮细胞特异性蛋白标记物E-钙黏蛋白和紧密连接蛋白ZO-1这两种兔的上皮细胞特异性抗体对草鱼第2代肠道细胞进行免疫荧光检测，结果显示鱼肠道细胞特异性表达E-钙黏蛋白和紧密连接蛋白ZO-1即为肠道上皮细胞。

9.一种鱼肠道上皮细胞的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包含权利要求1-8任一项所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法。

10.权利要求1-8任一项所述的鱼类靶向基因营养调控细胞模型的建立方法的应用，其特征在于，所述应用为将所述方法获得的鱼类靶向基因营养调控细胞模型，即鱼肠道上皮细胞系用于鱼类靶向基因营养调控模型研究、鱼类外源物质的调控作用及机制研究、鱼类分子营养技术与饲料精准配方研究或鱼类饲料添加剂筛选与鉴定的体外实验。