[发明专利]一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种α‑L‑鼠李糖苷酶、其制备方法和应用，属于基因工程和生物催化领域。具体涉及一种新型α‑L‑鼠李糖苷酶氨基酸序列和编码基因、含有上述基因的重组载体和重组微生物、利用上述重组微生物发酵制备α‑L‑鼠李糖苷酶的方法以及所述α‑L‑鼠李糖苷酶在水解薯蓣皂苷制备薯蓣皂素中的应用。本发明提供的α‑L‑鼠李糖苷酶可以特异性水解植物黄姜中甾体皂苷C₃位置外侧α‑L‑1,2‑鼠李糖苷键，具有催化效率高、热稳定性好、糖耐受性高等优点。此外，在所述α‑L‑鼠李糖苷酶和β‑D‑葡萄糖苷酶的共催化下，黄姜粗提物中的甾体皂苷几乎完全转化为薯蓣皂素，转化率高达98.5%，表明其在规模化皂素生产中具有良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程和生物转化领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。

背景技术

鼠李糖苷酶属于水解酶大类，广泛存在于动物、植物以及微生物中，可用于水解α-1,2、α-1,3、α-1,4以及α-1,6等连接的鼠李糖苷键，在食品、医药以及化工行业有重要的应用潜力，其中高热稳定性、高催化效率以及高糖耐受性的酶对于工业酶催化应用至关重要。

盾叶薯蓣（Dioscores zingiberensis C.H. Wright，简写DZW），又名黄姜，可直接入药，具有清热解毒等功效。薯蓣皂素（Diosgenin）是黄姜中的重要活性成分，具有众多药理活性，如抗肿瘤、抗炎等。此外，薯蓣皂素更是甾体药物合成的重要前体，被誉为“药用黄金”和“激素之母”，市场应用前景广阔。但皂素在天然植物中主要以皂苷形式存在，游离皂素含量极少。

传统皂素生产工艺主要涉及皂苷的化学酸解，但大量高色度、高酸度以及高COD的废水的产生对生态环境污染严重。随着各国环保政策的收紧，大量中小皂素生产企业由于巨大的环保压力而被迫停产，制约了皂素产业的发展。

近些年来，生物转化已被广泛应用天然药物开发领域，如稀有天然化合物的制备以及新药的发现等。皂素的生物制备具有条件温和、污染小、成本低、副产物少等优点而被受关注。目前已有米曲霉、烟曲霉以及青霉等微生物被陆续报道用来转化薯蓣皂苷制备皂素，但转化效率低、周期长、规模生产潜力不足（中国专利申请公开号：107177662A、101012474B、103146795A等）。

此外，使用来源于米曲霉的鼠李糖苷酶以及新月弯胞霉的葡萄淀粉酶酶等催化水解甾体皂苷也被报道。但是现有的酶存在热稳定性差、活性低以及糖耐受性低等缺点，限制了皂素的规模酶法生产（中国专利申请公开号：105925559A、101857855B等）。

现有报道的甾体皂苷水解酶在活性、稳定性以及耐糖性方面均显不足，难以应用于皂素的工业化生产。因此，高活性、高稳定性、高耐糖性的新型糖苷酶是实现薯蓣皂素高效酶催化制备的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高活性、高稳定性、高耐糖性的新型α-L-鼠李糖苷酶，所述糖苷酶氨基酸序列和编码所述氨基酸序列的核苷酸序列、用于表达所述糖苷酶的表达载体、包含或整合所述表达载体的宿主细胞、以及上述α-L-鼠李糖苷酶在薯蓣皂素生产中的应用。

为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为将SEQ ID NO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有α--L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质，优选为与SEQ ID NO.1有60%以上的相似度。更优选为80%或90%以上。