[发明专利]一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种alpha‑L‑鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。具体涉及一种新型alpha‑L‑鼠李糖苷酶的氨基酸序列、编码上述氨基酸序列的核苷酸序列、含有上述核苷酸序列的重组载体和重组宿主、利用上述重组宿主制备alpha‑L‑鼠李糖苷酶的方法以及所述alpha‑L‑鼠李糖苷酶在宝霍苷I生产中的应用。本发明所提供的alpha‑L‑鼠李糖苷酶具有催化效率高、热稳定性好、特异性高等优点。朝藿定C经葡萄糖苷酶快速催化水解后，再利用本发明中所提供的alpha‑L‑鼠李糖苷酶进一步催化水解其C₃位置外侧鼠李糖苷键生成宝霍苷I，底物转化率高达99.5%、转化效率高、无副产物、步骤简单、反应时间短、污染小、适合工业化生产。

技术领域

本发明属于基因工程和生物转化领域，具体涉及一种alpha-L-鼠李糖苷酶、其制备方法及应用。

背景技术

淫羊藿又名仙灵脾、刚前，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效。目前淫羊藿品种多达40个，包括柔毛淫羊藿、箭叶淫羊藿和朝鲜淫羊藿等。 淫羊藿药材中主要含有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷等主要黄酮苷，其中淫羊藿苷占比10%左右；朝藿定A和B合计占比10%；而朝藿定C（图1）是淫羊藿中含量最高的黄酮皂苷，约占70%，其C₃位置和C₇位置分别带有两个鼠李糖基和一个葡萄糖基。

宝藿苷I（图1），又名淫羊藿次苷II（Icariside II），具有抗肿瘤、治疗骨质疏松、调节免疫力等功效，市场应用前景广阔。天然植物中宝霍苷I的含量很少（低于0.2%），因而宝霍苷I 的制备通常采用水解黄酮苷实现，如可通过水解去掉淫羊藿苷C₇位置葡萄糖苷键获得宝霍苷I，其结构式如图1。由于酸解法具有环境污染大，特异性低等缺点而很少被应用于宝霍苷I的制备。

目前宝霍苷I 的制备多采用酶催化法，具有条件温和，特异性高，环境污染小等优点。宝霍苷I的制备最初采用葡萄糖苷酶或产葡萄糖苷酶的微生物来转化淫羊藿苷（图1）得到宝霍苷I（中国专利申请号：200780034447.9），后来又报道有其他葡萄糖苷酶、纤维素酶或葡聚糖酶也可以实现宝霍苷I的生产（中国专利申请号：201110186207.9、201880038006.4、201710333064.7、201110428197.5），相关报道的糖苷酶水解断裂的是淫羊藿苷C₇位置的葡萄糖苷键，且酶催化的效率有限。此外，中国专利（中国专利申请号:201810110773.3）公开了一种鼠李糖苷酶水解朝藿定C外侧鼠李糖苷键，弥补了使用alpha-L-鼠李糖苷酶水解朝藿定C鼠李糖与鼠李糖之间的alpha-1,2糖苷键的空白，但是摩尔转化率只有90.5%。因此一种高活性，高催化效率的糖苷酶对于宝藿苷I的制备至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新型alpha-L-鼠李糖苷酶、编码所述糖苷酶的核苷酸序列、用于表达所述糖苷酶的表达载体、包含或整合所述表达载体的宿主细胞以及所述alpha-L-鼠李糖苷酶在宝霍苷I生产中的应用。提供本发明是根据现有鼠李糖苷酶催化效率低、底物转化率低以及反应时间长等不足作出创新和改进。

为实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

一种alpha-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或为将SEQ IDNO.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成的有alpha-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质，该蛋白质优选为与SEQ ID NO.1有60%以上的相似度，更优选为80%或90%以上。

一种核苷酸序列，编码所述的alpha-L-鼠李糖苷酶，或者为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。其中编码SEQ ID NO.1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。