[发明专利]一种SalI限制性内切酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种SalI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：一、合成SalIM和SalI的编码基因，分别如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示，分别构建至相应载体中，获得带有SalIM基因的重组载体和融合了纯化标签的SalI蛋白表达质粒；二、将带有SalIM基因的重组载体转入大肠杆菌中，获得具备基底SalIM表达的重组菌，保护基因组DNA不被SalI内切酶切割，使大肠杆菌能够继续正常生长增殖，从而提高SalI的表达量。三、制作成具备基底SalIM表达的重组菌感受态细胞；四、将融合了纯化标签的SalI蛋白表达质粒转入具备基底SalIM表达的重组菌感受态细胞中，获得阳性单克隆，培养进行SalI限制性内切酶的表达；五、SalI限制性内切酶的纯化。

技术领域

本发明涉及分子生物学和细胞工程领域，特别涉及一种SalI限制性内切酶的制备方法。

背景技术

SalI是白色链霉菌G(Streptomyces albus G)体内的一种二型限制性内切酶，其特点在于它特异性的识别双链DNA中的GTCGAC并分别在双链5’端之后第一个G残基进行切割(如图1所示)。切割后的片段具有黏性末端，是遗传及基因工程上实用性较高的限制酶种类。

传统蛋白表达方法将SalI表达的构建质粒直接转入大肠杆菌中进行表达。但是，作为一种限制性核酸内切酶，其在大肠杆菌内的重组表达会严重抑制宿主菌基因组复制，其基底表达会导致克隆菌种无法正常增殖。因此，难以拿到大量的SalI蛋白。目前尚无国内外文献介绍SalI的重组表达与纯化方法。国际上对于限性内切酶的表达常采用低背景表达菌株表达法如使用BL2(DE3)plysS表达HindIII(Watanabe,N.,Takasaki,Y.,Sato,C.,Ando,S.,and Tanaka,I.(2009)Structures of restriction endonuclease HindIII incomplex with its cognate DNA and divalent cations.Actacrystallographica.Section D,Biological crystallography 65,1326-1333)。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种能提高SalI表达量的重组表达与纯化方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是如何提高SalI蛋白在原核表达菌株中的表达量。

为实现上述目的，本发明的一个方面提供了一种SalI限制性内切酶的制备方法，在原核表达菌株中同时表达SalI和SalIM。可选地，SalI和SalIM改造去除了序列中的SalI酶切位点。

进一步地，SalIM的DNA及氨基酸序列如SEQ ID No.1，SEQ ID No.3所示，或者其氨基酸序列与SEQ ID No.3具有至少95％及以上的相似性；所述SalI的DNA及氨基酸序列如SEQ ID No.2，SEQ ID No.4所示，或者其氨基酸序列与SEQ ID No.4具有至少95％及以上的相似性。

进一步地，原核表达菌株包括大肠杆菌。可选地，原核表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

进一步地，该方法包括：先在所述原核表达菌株中转化入含有SalIM的重组质粒，使得原核表达菌株进行SalIM表达并进行基因组保护修饰；然后在含有SalIM的重组质粒的原核表达菌株中进一步转化入含有SalI的重组质粒，获得含有SalIM的重组质粒和含有SalI的重组质粒的原核表达菌株。

进一步地，将含有SalIM的重组质粒的原核表达菌株制备成感受态细胞，并在所述感受态细胞中转化入含有SalI的重组质粒。

进一步地，含有SalIM的重组质粒不含纯化标签，含有SalI的重组质粒带有纯化标签。进一步地，纯化标签选自MBP、GST或6*HIS。