[发明专利]一种液质联用测定生物体液样品中cGMP浓度的检测方法

说明书

本发明属于药物分析技术领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种液质联用测定生物体液样品中cGMP浓度的检测方法。本发明公开了一种液质联用测定生物体液样品中cAMP浓度的高灵敏方法，包括下列步骤：(1)待测样品预处理；(2)液相色谱‑质谱联用检测进行标准曲线制备；(3)液相色谱‑质谱联用检测待测样品中cGMP浓度浓度。本发明方法快速、准确、灵敏度高，样品预处理方法简单，重复性良好，精密度与准确度较高，灵敏度高，且检测限较低。

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种液质联用测定生物体液样品中cGMP浓度的检测方法。

背景技术

环磷鸟嘌呤核苷(cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)广泛分布于各种组织中，其含量约为cAMP的1/10～1/100，由鸟苷酸环化酶催化GTP而生成，被磷酸二酯酶分解。cGMP与cAMP的作用相反，cGMP有乙酰胆碱的作用，抑制心肌收缩力，降低心率，增加神经兴奋性，刺激白细胞溶酶体释放水解酶，刺激淋巴细胞分裂增殖，抑制糖异生以及兴奋副交感神经的功能。因此，检测动物血浆与尿液中cGMP浓度具有重要的生理意义，对于评价药物对动物分泌环磷酸腺苷的影响也有重要作用。

目前，最常用的体液(血浆、尿液、脑脊液等)中cAMP检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)。虽然ELISA应用较广泛，但是仍存在一些缺点，主要为操作过程有些繁琐，易出现假阳性结果，重复性待提高。液相色谱串联质谱法相对于ELISA具有更加简单、快速、准确的优点。

食蟹猴在遗传和生理上与人类相似，是生物医学研究和药物研发的常用模式生物，目前尚未测定食蟹猴血浆与尿液中环磷鸟嘌呤核苷浓度的的文献报道。本方法除首次建立了食蟹猴血浆与尿液中体液中cGMP液相色谱串联质谱检测法外，并且针对现有方法检测过程繁琐、时间长的缺点进行了改进和优化，以节省检测时间、同时保证了检测的准确性和可靠性，从而使之更加有利于评价药物和临床样本的高通量筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种液质联用测定生物体液样品中cGMP浓度的高灵敏方法。

本发明公开了一种液质联用测定生物体液样品中cGMP浓度的高灵敏方法，包括下列步骤：

(1)待测样品预处理；

(2)液相色谱-质谱联用检测进行标准曲线制备；

(3)液相色谱-质谱联用检测待测样品中cGMP浓度；

所述待测样品预处理为待测样品处理采集前需要加入磷酸二酯酶抑制(PDEs)剂作为稳定剂。

在一优选例中，所述生物体液样品为血浆、尿和/或脑脊液；

优选例中，磷酸二酯酶抑制剂优选为PDE1选择性抑制剂或PDE5选择性抑制剂，更优选为IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、尼莫地平、长春西汀、IC86340、IC224、EHNA、BAY60-7750、IC933、双嘧达莫、西洛他唑、西洛酰胺、米力农、氨力农、依诺昔酮和、氰胍佐旦、茶碱、咯利普兰、吡拉米司特、罗氟司特、西洛司特、BRL-50481、IC242、喹唑啉类小分子化合物S14、噻二唑类小分子化合物VP1.15；最优选为IBMX。

在一优选例中，所述待测样品预处理为血浆或尿液以EDTA-K2与IBMX为抗凝剂与稳定剂，以待测物的氘代化合物为内标，取一定体积的血浆与尿液样品，加入一定体积的氘代内标混合溶液，混合后，采取液液萃取或固相萃取，离心取上清，得到待测样品；

在一优选例中，所述待测样品预处理为为血浆以EDTA-K2为抗凝剂，以各自待测物的氘代化合物为内标，样品处理采集前需要加入1％的100mM IBMX作为稳定剂，在50.0uL的血浆样品，加入50.0uL的的内标混合溶液，混合后，加入300uL乙腈，涡旋混合10min，在4℃条件下2600g离心10min，取200μL上清液，得到待测样品；