[发明专利]低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法

权利要求书

1.低产乙醛啤酒酵母菌株的高效选育方法，其特征在于，包括以下步骤：

对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理，构建突变菌株库；

利用乙醇-双硫仑抗性平板和高浓度乙醛筛选平板从突变菌株库中筛选得到生长优势菌株，并利用液体驯化培养基对生长优势菌株进行驯化，建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株；

对所得初筛菌株进行发酵培养，并以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标进行复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒酵母。

2.根据权利要求1所述的高效选育方法，其特征在于，所述对啤酒酵母菌株进行ARTP诱变处理具体为：

将培养至对数中期的菌体稀释至1×10⁶个/mL，利用氦气离子束对酵母细胞进行ARTP诱变处理。

3.根据权利要求2所述的高效选育方法，其特征在于，所述ARTP诱变处理的条件为：

氦气流速15.0L/min、输入功率100W、处理距离2mm、处理温度＜40℃和诱变时间90s。

4.根据权利要求1所述的高效选育方法，其特征在于，所述建立诱变-筛选-驯化的初筛菌株具体为：

1)对突变菌株库中的啤酒酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；

2)对细胞悬浮液进行ARTP诱变处理，得到诱变菌液；

3)将诱变菌液分别涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，进行恒温培养，挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化；

4)分别吸取适量驯化菌液重复上述步骤2)-3)至少2-6轮，且提高每一轮平板的筛选浓度和驯化培养基浓度，将最终驯化菌液分别涂布于两种平板上，得到初筛菌株。

5.根据权利要求4所述的高效选育方法，其特征在于，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-48h；

菌体离心后洗涤重悬于含有1-20％甘油的无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×10⁴-1×10⁸个/mL。

6.根据权利要求4所述的高效选育方法，其特征在于，所述步骤2)中，细胞悬浮液的取用量为1-20μL；

ARTP诱变处理条件为：氦气流速5-45L/min、输入功率70-120W、处理距离1-4mm、处理温度低于60℃和诱变时间30-180s。

7.根据权利要求4所述的高效选育方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述诱变菌液的吸取量为5-200μL；

所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；

恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为1-5d；

所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；

所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；

驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为1-5d。

8.根据权利要求1所述的高效选育方法，其特征在于，以乙醇脱氢酶Ⅰ、Ⅱ和乙醛脱氢酶的酶活力变化为指标，选择三种酶活力正突变幅度总和大于65％的初筛菌株作为复筛菌株。

9.根据权利要求1所述的高效选育方法，其特征在于，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。

10.根据权利要求9所述的高效选育方法，其特征在于，所得低产乙醛啤酒酵母的乙醛产量降低50％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒酵母菌株无显著差异。