[发明专利]低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法

权利要求书

1.低产乙醛啤酒工业酵母的高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

对啤酒工业酵母进行⁶⁰Coγ诱变处理，构建突变菌株库；

利用高浓度乙醛平板及乙醇-双硫仑平板对突变菌株进行平板筛选，并利用对应上述各平板的液体驯化培养基对其进行长期驯化，将驯养菌液分别涂布于上述平板，获得初筛菌株；

利用低乙醛合成能力及强乙醛代谢能力对初筛菌株进行高通量复筛，得到复筛菌株，即低产乙醛啤酒工业酵母。

2.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，获得初筛菌株具体包括以下步骤：

1)对突变菌株库中的啤酒工业酵母菌株进行划线培养，挑取单菌落于YPD培养基中生长，离心菌体，洗涤重悬，得到细胞悬浮液；

2)对细胞悬浮液进行⁶⁰Coγ照射，将照射后的菌液立即涂布于高浓度乙醛平板和乙醇-双硫仑平板上，恒温培养；

3)挑取上述平板上的生长优势菌株分别于对应上述平板的驯化培养基中进行连续驯化，驯化过程中逐步提高各平板中乙醛及双硫仑的筛选浓度；

4)分别吸取适量驯化菌液涂布于上述平板，得到初筛菌株。

3.根据权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中，菌落的生长温度为25-35℃，培养时间为6-20h；

菌体离心后洗涤重悬于含有1-20％甘油的无菌生理盐水中，并将浓度稀释至1×10⁴-1×10⁸个/mL。

4.根据权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中，选取0-2.0kGy的辐照剂量，吸取5-200μL辐照菌液涂布于筛选平板；

所述高浓度乙醛平板为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基，所述乙醇-双硫仑平板为含有0-50g/L乙醇、0-5mg/L双硫仑的基础碳源培养基；

恒温的培养温度为20-40℃，培养时间为12-120h。

5.根据权利要求2所述的高通量筛选方法，其特征在于，所述高浓度乙醛驯化培养基为含有0.1-10g/L乙醛的YPD培养基；

所述乙醇-双硫仑驯化培养基为含有0-50g/L乙醇、0-10mg/L双硫仑的基础碳源培养基；

驯化的驯化温度为20-40℃，驯化时间为5-70d。

6.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，低乙醛合成能力的高通量筛选方法具体为：

将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤重悬，稀释至OD₆₀₀为5时，按1％的接种量接入含有5g/L乙醇的基础碳源培养基的96深孔细胞培养板，用6mm橡胶密封帽盖密封，以30℃、200rpm条件培养，每24h定期取样，检测乙醛生成情况。

7.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，强乙醛代谢能力的高通量筛选方法具体为：

将培养至对数中期的初筛菌株用生理盐水洗涤，离心弃上清，加入100mg/L乙醛标准溶液，保证60μL溶液的OD₆₀₀为0.15，每隔30min取样，检测乙醛余量。

8.根据权利要求1所述的高通量筛选方法，其特征在于，在得到复筛菌株后，还包括通过实验室摇瓶水平发酵对所得复筛菌株的风味物质进行测定的步骤。

9.根据权利要求8所述的高效选育方法，其特征在于，所得低产乙醛啤酒工业酵母的乙醛产量降低60％以上，且主体风味与最初进行筛选的啤酒工业酵母菌株无显著差异。