[发明专利]一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法

说明书

本发明公开了一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8‑WUS‑RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测。其中，转化载体pER8‑WUS‑RdCodA的构建包含：将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，将其插入酶切后的pER8载体中，将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入EcoR V位点，以构建转化载体pER8‑WUS‑RdCodA。本发明的方法能够缩短转化周期，提高转化效率。

技术领域

本发明涉及一种遗传转化的方法，具体涉及一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法。

背景技术

竹子是重要的森林资源之一，具有分布广、生长快、用途多、生态和经济价值高等特点。竹子开花周期长，开花后死亡，杂交育种非常困难，缺乏生产上急需的优新品种。自上世纪80年代以来，已经对毛竹属(Phyllostachys)、牡竹属(Dendrocalamus Nees)、麻竹属(Dendrocalamus)、赤竹属(Sasa Makinoet Shibata)以及泰竹属(Thysostachys Gamble)等20余属70多个竹种不同的外植体和培养条件进行组织培养研究，获得了愈伤组织或丛生芽，并在一些竹种上诱导出了完整的再生植株。但是，目前竹子组织培养成功的报导中，90％集中于丛生竹种，且植株再生效率普遍较低。在麻竹中已有遗传转化的成功报道，但是仍然存在转化周期长和转化效率低等问题。

毛竹(Phyllostachys edulis)是大型散生竹种之一，是中国栽培悠久、面积最广、经济价值也最重要的竹种。Yuan等利用毛竹成熟种子诱导愈伤并获得了再生植株，但是该体系存在外植体灭菌困难，诱导和再生效率低等问题，毛竹中尚未有遗传转化的成功报道。

综上所述，毛竹再生体系尚不完善，尚无遗传转化体系。稳定高效的毛竹遗传转化体系已经成为制约毛竹生物技术育种的关键技术障碍。

发明内容

本发明的目的是提供一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，解决了毛竹再生体系尚不完善的问题，能够提高抗性愈伤组织的增殖和状态的改善，缩短转化周期，提高转化效率。

为了达到上述目的，本发明提供了一种毛竹幼胚离体再生及遗传转化的方法，该方法包含：毛竹幼胚愈伤组织的诱导、毛竹愈伤组织的增殖、转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建、农杆菌侵染、毛竹抗性愈伤组织的筛选与不定芽的分化、转基因植株再生与炼苗移栽和毛竹转基因再生植株检测。

所述毛竹幼胚愈伤组织的诱导，包含：对未成熟毛竹种子灭菌后，将胚剥离于愈伤诱导培养基上，25±1℃暗培养，以诱导出愈伤组织；其中，所述愈伤诱导培养基的组分包含：MS培养基、2.0～6.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8。其中，2,4-D浓度低于2.0mg/L则无法抑制胚芽萌发，不利于愈伤组织诱导，而浓度高于6.0mg/L则不利于后续愈伤组织的增殖和分化。

所述毛竹愈伤组织的增殖，包含：将所述愈伤组织转置于继代培养基中进行继代培养，25±1℃暗培养；其中，所述继代培养基的组分包含：MS培养基、0.1mg/L或1.0mg/L的2,4-D、30g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH＝5.8；采用含0.1mg/L2,4-D的继代培养基和1.0mg/L2,4-D的继代培养基交替进行继代培养。

所述转化载体pER8-WUS-RdCodA的构建，包含：将雌二醇诱导载体pER8进行Xho I/Spe I双酶切，以获得pER8线性化载体；在玉米WUS基因两端加入载体同源序列，并通过同源重组的方法将其插入pER8线性化载体中，获得重组载体pER8-WUS；采用EcoR V对重组载体pER8-WUS进行单酶切，获得载体片段；将Rd29A启动子诱导的CodA基因完整表达框插入经单酶切获得的pER8-WUS载体片段的EcoR V位点，以构建转化载体pER8-WUS-RdCodA。