[发明专利]一种肺炎球菌多糖的纯化工艺

说明书

本发明公开了一种离子交换层析纯化肺炎球菌多糖的工艺。步骤包括：肺炎球菌经发酵培养、灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到肺炎球菌多糖粗提溶液，通过离子交换层析工艺，去除不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖纯化过程的杂质，得到符合要求的肺炎球菌多糖。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种肺炎球菌多糖的纯化工艺。

背景技术

层析技术是生物大分子分离纯化最有效的手段之一,具有多种不同的分离机理如离子交换、疏水、反相、金属鳌合、亲和、凝胶过滤等,可以实现很高的分离度,且设备简单,便于自动化控制,不会在分离过程中出现发热、相变等效应,因此在实际的生物大分子分离纯化中的应用越来越广泛。离子交换层析是以离子交换剂为固定相,以特定的含离子的溶液为流动相,利用离子交换剂对需要分离的生物大分子结合的差异,而将混合物中各种物质进行分离的层析技术。

肺炎球菌荚膜多糖是制备肺炎球菌相关疫苗的有效抗原。肺炎球菌荚膜多糖经细菌发酵培养后，现有的肺炎球菌多糖的纯化工艺是苯酚抽提和乙醇分级沉淀纯化得到。然而苯酚对皮肤、粘膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能，对环境水体和大气都可造成污染。乙醇是易燃易爆危险化学品，对生产厂房设计要求极高，对生产成本影响很大。并且有毒、有害和污染严重的有机化剂的使用对工作人员和环境造成危害，所以研制创新性的、安全和有效的纯化工艺是迫切需要的。

本发明的纯化工艺，是指肺炎球菌经发酵培养、灭活、澄清、超滤浓缩等步骤得到粗纯肺炎球菌多糖，然后经离子交换层析去除蛋白和核酸等杂质，最终得到肺炎球菌荚膜多糖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肺炎球菌多糖的纯化工艺。

本发明主要是针对层析过程，层析使用的介质为阴离子交换介质，不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖的性质，使用不同稀释液，达到去除杂质的目的；针对不同血清型的肺炎球菌荚膜多糖的性质，使用不同上样量，提高了层析的效率；并优化了层析介质的清洗程序，延长了层析介质使用寿命。

现有方法制备得到的肺炎球菌多糖，纯度比较低，为粗纯多糖。本发明对粗纯多糖作进一步层析纯化，得到纯度更高的肺炎球菌荚膜多糖。

具体的，本发明所述的肺炎球菌多糖的纯化工艺，包括以下步骤：

(1)配制层析平衡液为0.01mol/L至0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液，pH值范围为6.0至7.6。

(2)将肺炎球菌粗纯多糖溶液超滤浓缩，超滤膜包截留分子量为10到100Kd，使用层析平衡液透析，透析后收集超滤浓缩液。

(3)用层析平衡液平衡层析柱。

(4)上样，使用平衡缓冲液洗脱，监测206nm的紫外吸收峰，收集流穿峰。

其中，层析使用的离子交换介质为离子交换介质DEAE Sepharose FF。

其中，肺炎球菌粗纯多糖，可以在市场上购买到，也可以根据常规方法制备得到。

此处，列举一种肺炎球菌粗纯多糖的制备方法，当然还可以根据其他方法制备得到。

其中，肺炎球菌粗纯多糖的制备步骤为：

24个血清型中的任一个肺炎链球菌血清型进行发酵，肺炎球菌灭活，发酵液澄清，发酵液进行超滤浓缩，加CTAB使其与多糖形成沉淀，离心收集沉淀，再经过氯化钠解聚，离心收集上清，超滤浓缩和缓冲液置换，层析纯化多糖，注射用水超滤除盐，冻干，最终得到肺炎球菌粗纯多糖。

本发明所述的纯化工艺，适用于肺炎链球菌血清型为1型、2型、3型、4型、5型、6A型、6B型、7F型、8型、9N型、9V型、12F型、10A型、11A型、12F型、14型、15B型、17F型、18C型、19A型、19F型、20型、22F型、23F型和33F型。