[发明专利]一种复合菌液制剂的制备方法

说明书

本发明公开了一种复合菌液制剂的制备方法，先通过菌种活化、种子液的制备、摇瓶培养得到嗜麦芽寡养单胞菌发酵液；然后制备微生态制剂；再制备无机营养液，最后将嗜麦芽寡养单胞菌微生态制剂加入无机营养液中，边搅拌边调节pH至6.0‑7.0之间，制得复合菌液制剂。本复合菌剂添加小分子酸及共代谢底物，缩短菌种降解周期，提高菌种单位时间内降解多环芳烃能力以及菌种在工业环境中的适应性，同时使得复合菌剂的活菌数保持在较高的水平95‑105亿cfu/ml，储存时间延长，多环芳烃降解率达85％。

技术领域

本发明涉及一种复合菌液制剂的制备方法，尤其涉及一种多环芳烃降解菌制剂的制备方法，可用于污染地区的多环芳烃降解处理，以指导生物技术研究，修复受污染区域或多环芳烃污染物处理，属于生物工程领域。

技术背景

石油作为矿产资源中不可或缺的一部分，在制造业、农业以及医药领域都有着广泛应用。随着石油工业开发速度不断加快，石油化工产品的应用范围不断扩大，石油污染的问题日益严重。石油烃包括烷烃、环烷烃以及芳香烃，其中以芳香烃类中的多环芳烃毒性最强。

与外国油田相比，我国油田开发与城市建设密不可分、相互交错，这使得油田污染土壤对生态环境和人体健康的影响显得更加敏感和突出。多环芳烃(PAHs)的去除除了常见的物理、化学方法外，还包括生物法治理手段。其中微生物降解法因为其较其他降解方法成本较低、操作方便等优点，逐渐成为石油烃降解的主要研究方向。

复合菌液的配置和优化是工业化处理多环芳烃污染的关键技术。现有的生物法处理多环芳烃污染普遍存在多种问题，单一菌种的适应性弱，抗逆性差，且与土著微生物的竞争中一直处于弱势地位，严重制约多环芳烃微生物法降解的发展。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的缺点和不足，而提供一种用于多环芳烃降解的复合菌液制剂的制备方法。

本发明的技术方案为：一种复合菌液制剂的制备方法，其具体步骤如下：

(1)通过菌种活化(菌种为市售的嗜麦芽寡养单胞菌CGMCC 1.14975)、种子液的制备、摇瓶培养得到嗜麦芽寡养单胞菌发酵液；

(2)微生态制剂的制备：对发酵液进行离心，弃上清液，收集离心后的菌体，将嗜麦芽寡养单胞菌菌体、海藻糖和脱脂乳按照体积比(1.5-2):(1.5-2):1的比例混合均匀，将样品在超低温冰箱预冻后，放入冷冻干燥机进行真空冷冻干燥，得嗜麦芽寡养单胞菌微生态制剂，目标微生态制剂的多环芳烃降解率达60％～70％；

(3)无机营养液的制备：将MgSO₄、苯胺、L-苯丙氨酸、酒石酸、水杨酸、KH₂PO₄、水按照质量比(2-4)：(2-4)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：(1-2)：10000的比例混合，搅拌均匀，充分溶解，静置冷却到室温，得到混合溶液；

(4)复合菌液制剂的制备：将步骤(2)得嗜麦芽寡养单胞菌微生态制剂加入步骤(3)制备的无机营养液中，其中嗜麦芽寡养单胞菌微生态制剂的加入质量与无机营养液的体积比为10-15mg/mL；边搅拌边调节pH至6.0-7.0之间，制得复合菌液制剂。

本发明所述的菌种是市售的嗜麦芽寡养单胞菌，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号是CGMCC1.14975的嗜麦芽寡养单胞菌。

优选步骤(1)中所述的菌种活化为：将嗜麦芽寡养单胞菌单菌落转接到种子斜面培养基，活化培养温度为28-30℃，培养24-30h；其中种子斜面培养基成分为：菲100-150mg/L、蛋白胨5-10g/L、氯化钠1-5g/L、琼脂10-25g/L。