[发明专利]一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法

权利要求书

1.一种基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备高密度微管荧光标记的细胞样品；

(2)锚定：使用6-丙烯氨基乙酸琥珀酸酯对所述高密度微管荧光标记的细胞样品中蛋白质进行锚定；

(3)凝胶化：将步骤(2)中获得的锚定后的生物细胞置于冰面上，快速混合384μL凝胶单体溶液与8μL加速剂，再迅速混合8μL的引发剂并摇匀，快速加入到生物细胞的玻底皿中，再放入细胞培养箱中孵育1h形成凝胶；

(4)消化：将步骤(3)所得凝胶加入4.5mL消化缓冲液，锡纸封装后置于摇床上过夜反应；

(5)膨胀：将步骤(4)获得消化后的凝胶加入去离子水置于摇床上透析，每隔1h换一次去离子水，重复3-5次，直至膨胀至样本体积不再变化；

(6)成像：在吸水膨胀后的凝胶样品加入成像缓冲液后，置于超分辨显微镜下成像，得到基于高密度标记法的细胞微管膨胀显微图像。

2.如权利要求1所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：步骤(1)中所述制备高密度微管荧光标记的细胞样品，其包括如下步骤，

使用PBS缓冲液清洗细胞，使用0.01％的Triton X-100溶液对细胞进行透膜处理，反应时间为12-13分钟；

使用PBS缓冲液清洗细胞，加入固定液对细胞进行固定，静置20分钟；

将细胞置于摇床上，使用PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟；

使用1mg/mL的NaBH₄溶液除去非特异性荧光，摇床反应7分钟，然后使用PBS缓冲液清洗细胞；

使用山羊血清进行封闭，室温下摇床反应60-90分钟，再使用PBS缓冲液清洗细胞；

加入微管一抗，4℃过夜反应后将细胞置于摇床上，再使用PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟；

加入AlexaFluor488标记的二抗，摇床反应2小时以上，再使用PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟，得到高密度微管荧光标记的细胞样品。

3.如权利要求1或2所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：所述的凝胶单体溶液为0.38g/mL丙烯酸钠溶液、0.5g/mL丙烯酰胺溶液、0.02g/mLN，N-二甲基丙烯酰胺溶液、0.292g/mL氯化钠溶液、0.1mol/LPBS、去离子水按照体积比45：10：15：80：20：18配制而成。

4.如权利要求1或2所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：所述成像缓冲液为10μL/mL巯基乙醇、50μg/mL葡萄糖氧化酶、50μg/mL过氧化氢酶、100mg/mL葡萄糖按照体积比45：10：15：80：20：18配制成，共计2mL。

5.如权利要求1或2所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：所述的消化缓冲液为0.05mol/L Tris溶液、0.001mol/L EDTA溶液、0.5％TritonX-100、0.8mol/L guanidine HCl溶液按照体积比45：10：15：80：20：18混合得到初混液，取4.5mL初混液加入占所述初混液体积比1：1500的K蛋白酶混合而成。

6.如权利要求1或2所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：所述的加速剂为质量比为10％的TEMED溶液；所述的引发剂为质量比为10％的APS溶液。

7.如权利要求1所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：步骤(6)中，所述成像采用的激发光波长为488nm，收集495-575nm之间的荧光信号进行超分辨成像。

8.如权利要求7所述的基于高密度荧光标记法的细胞微管膨胀显微成像方法，其特征在于：所述成像，其时间为60分钟以内。