[发明专利]一种利用双重巢式RT-PCR检测GRSPaV的方法

说明书

本发明公开了一种利用双重巢式RT‑PCR检测GRSPaV的方法，属于分子生物学技术领域。本发明公开的一种利用双重巢式RT‑PCR检测GRSPaV的方法，包括两轮PCR扩增；本发明方法可在一种病毒的两个基因上同时进行巢式扩增，其检出率与两个片段单一巢式PCR的检出率总和相同；本发明方法可有效降低检测成本、提高检测速度，而且操作简单、稳定性好，为GRSPaV的快速检验和脱毒研究提供了有力的支持。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及一种利用双重巢式RT-PCR检测GRSPaV的方法。

背景技术

沙地葡萄茎痘伴随病毒(grapevine rupestris stem pitting-associatedvirus，GRSPaV)在世界范围的葡萄产区均有发生，是分布最广的葡萄病毒，与葡萄叶脉坏死、沙地葡萄茎痘、西拉葡萄衰退等多种病害有关。GRSPaV为韧皮部限制性病毒，主要通过嫁接传播；该病毒隶属凹陷病毒属，基因组具有较高的变异性。

因此，提供一种利用双重巢式RT-PCR检测GRSPaV的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种利用双重巢式RT-PCR检测GRSPaV的方法，操作简单，稳定性好。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用双重巢式RT-PCR检测GRSPaV的方法，具体步骤如下：

(1)样品总RNA提取；

(2)cDNA合成；

(3)第1轮PCR体系：cDNA 2μL、10×PCR Buffer2.5μL、2.5mmol/L each dNTPs 0.7μL、10μmol/L引物组合P1/P2-P3/P4用量为0.4/0.4-0.4/0.4μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.05μL，定容至25μL；

引物组合P1/P2-P3/P4扩增程序：94℃预变性3min；94℃30s，55℃45s，72℃50s，共30个循环；72℃10min；

(4)第2轮PCR体系：以第1轮PCR扩增产物为模板，用量为1μL，其余成分为10×PCRBuffer 2.5μL、2.5mmol/L each dNTPs 1μL、10μmol/L引物组合P5/P6-P7/P8用量为0.3/0.3-0.3/0.3μL、5U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，定容至25μL；

引物组合P5/P6-P7/P8扩增程序：94℃预变性3min；94℃30s，55℃45s，72℃50s，共35个循环；72℃10min；

(5)第2轮扩增结束后取PCR产物在琼脂糖凝胶中进行分离，在BIO-RAD凝胶成像系统中，观察扩增结果。

进一步，步骤(3)所述引物组合P1/P2-P3/P4的引物序列如下：

P1：5’-CTCCAGAGGTGCTGGTTGGTTCTC-3’；SEQ ID NO.1；

P2：5’-CGGCAAAAGAACGATATGACCAACT-3’；SEQ ID NO.2；

P3：5’-AGGGCTACAGGGGAGTCAAT-3’；SEQ ID NO.5；

P4：5’-TACGGTATTCCAGCGAACAGGCTTA-3’；SEQ ID NO.6；

步骤(4)所述引物组合P5/P6-P7/P8的引物序列如下：

P5：5’-CCAGATGGCAATTGGAATGAGATG-3’；SEQ ID NO.3；