[发明专利]用于快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物、试剂盒、方法

说明书

本发明公开了用于快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物、试剂盒、方法，属于生物工程技术领域。本发明针对粟酒裂殖酵母乙醇脱氢酶基因Adh1设计了特异性引物SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3，可以通过PCR技术实现对大曲、酒醅等样本中粟酒裂殖酵母的快速定性、定量检测；准确性高、有效性好、灵敏性高。本发明技术方案适用发酵食品成品或者取自发酵食品发酵过程的样品。

技术领域

本发明涉及用于快速鉴定及定量粟酒裂殖酵母的引物、试剂盒、方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

目前，中国大部分名优白酒都使用传统的大曲法酿造。大曲是以大麦、小麦、豌豆等为原料，经过破碎、加水拌料、压成砖块状的曲醅后，在人工控制的温度、湿度下培养而成的。大曲中含有丰富的霉菌、酵母、细菌等微生物及它们产生的各种酶，是一种多菌种的混合粗酶制剂，其中，真菌的作用不容忽视。由于大曲中栖息着丰富的微生物，加曲不但使大量有益的酿酒微生物菌种直接转移到发酵酒醅，而且还给酒醅提供了以淀粉酶、蛋白酶为主的各种酶类，同时，大曲还给酒醅带来了数量可观的、多种多样的代谢产物，在赋予大曲酒更好的口味和香气方面起着重要作用。

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)是裂殖属的杆状酵母，被广泛应用于白酒酿造，是白酒酿造体系中的核心酵母，有较高的乙醇发酵能力，能够降低影响产品质量安全的氨基甲酸乙酯的浓度，是极具酿酒潜力的非酿酒酵母。筛选、鉴定和分析粟酒裂殖酵母，对改善白酒品质具有重要意义。现有的鉴定粟酒裂殖酵母的方法，主要利用菌株的理化性质或ITS4，这种鉴定方法存在周期长、费用高、成功率低等问题。

乙醇脱氢酶(Alcohol dehydrogenase，简称ADH)是一类具有高度保守结构域的氧化还原酶，典型的乙醇脱氢酶是一种锌结合酶，其结构域中有一个锌结合结构域。该酶可充当二聚体，并依赖NAD(P)⁺辅助因子来可逆转化乙醇和乙醛。乙醇脱氢酶的基本功能是在无氧呼吸时，在糖酵解的最后一步反应中，将乙醛转化为乙醇。该反应可有效减轻无氧呼吸产生的代谢产物对细胞自身的毒害作用。除此以外，乙醇脱氢酶催化乙醛生成乙醇的过程也伴随着能量分子ATP的生成。在NADH生成NAD⁺的过程中会伴随生成一个H⁺，通过电子传递链，最终这个能量会转化为ATP中的高能磷酸键中储存的能量。当酿酒酵母在可发酵碳源如葡萄糖上生长时，乙醇醇脱氢酶被认为主要负责通过催化乙醛还原产生乙醇而从NADH中再生NAD⁺。此外，不同的酵母编码乙醇脱氢酶的基因序列是不同的。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是现有的鉴定粟酒裂殖酵母的方法，主要利用菌株的理化性质或ITS4，这种鉴定方法存在周期长、费用高、成功率低等问题。

[技术方案]

本发明提供用于鉴定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的引物，其序列如SEQ ID NO：2(引物Adh1F：CAGTACTCGCAGTTACCGCA)、SEQ ID NO：3(引物Adh1R：TTGATCGGTGGTCACGAAGG)所示。

本发明还提供应用所述引物鉴定粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的方法，包括步骤：将待测样品制成菌悬液，将菌悬液稀释涂布获得单菌落，以SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示序列为引物进行菌落PCR，通过凝胶电泳观察PCR产物，如果电泳图谱上PCR 产物在100-250bp之间有条带，则说明样品中含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，如果PCR产物不在100～250bp之间或者没有条带时，说明样品中没有粟酒裂殖酵母。