[发明专利]一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法

权利要求书

1.一种利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法，其特征在于具体过程为：

步骤S1：将Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒培养于L8824细胞系中，培养后收集细胞培养液，离心取上清提取病毒RNA，通过反转录获得cDNA模板，根据GenBank中提交的S11序列设计引物，使用PCR扩增技术获得S11基因，随后将扩增的S11基因片段构建到pCAMBIA1303载体中，再进行双酶切和测序验证；

步骤S2：将验证正确的重组质粒pCAMBIA1303-S11与农杆菌EHA105感受态细胞混匀，冰浴后放入液氮中速冻1 min，然后在37℃水浴中放置5 min，接着冰浴2 min，然后加入1 mLYEP液体培养基，28℃、160 rpm振荡培养4 h，然后均匀涂布到含卡那霉素的LB固体培养基上，挑选单克隆进行PCR检测，阳性菌保存于15wt%甘油并放置在-80℃保藏备用；

步骤S3：将转有重组质粒的土壤农杆菌EHA105在50 mL YEP液体培养基中复苏摇菌至OD为0.5-0.8，离心后使用B5培养基重悬，加入乙酰丁香酮和吐温，混匀活化农杆菌，然后将脱菌的深绿色结实紧密的稀脉萍胚性愈伤块移入农杆菌悬浮液中，培养30 min后使用滤纸吸干愈伤组织表面的菌液，然后将愈伤组织转移到B5培养基中暗培养两天，待淡色的菌圈出现时，超声波清洗愈伤组织后使用筛选培养基筛选13-16 d，当愈伤组织达到5-6 mm移入再生培养基培养28-32 d获得再生植株。

2.根据权利要求1所述的利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法，其特征在于：步骤S1中所述pCAMBIA1303载体含有GUS和mGFP5双标签，用于方便外源基因表达的验证。

3.根据权利要求1所述的利用浮萍表达系统制备草鱼呼肠孤病毒口服亚单位疫苗的方法，其特征在于：步骤S1中所述PCR扩增技术获得S11基因的过程中扩增S11基因节段序列的引物为S11-F:CGGGGTACCCGCCACCATGGAACCAGCAAAACCATTG，S11-R:TGAGATCCAGGGACAGTCTGAGAAAGATGAGCTATAAGGATCCGCG，其中正向引物包括kpn1酶切位点GGGTACCC和kozak序列GCCACCATGG，反向引物包含BamH1酶切位点GGATCC和内质网滞留信号肽序列TCTGAGAAAGATGAGCTA。