[发明专利]用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法

权利要求书

1.治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗3-5遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入1-3mL血清并将其摇晃铺匀，将25-35块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔4-6mm，然后向无菌培养皿中加入3-4mL的完全培养液，静置培养3-5min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数3-5％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入2-4mL完全培养液，之后每2-3天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部80-90％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1-2次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1-2mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1-3min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；

第四步、用无菌吸管反复吹打细胞培养皿底部，得到脂肪源干细胞悬浮液，然后将悬浮液转移至无菌离心管中，以1200-1500r/min转速离心处理5min，倒去上清液后，加入完全培养液和抗凋亡保护剂，以1×10⁶/mL的浓度接种到新的培养瓶中进行传代培养，即得用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞。

2.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，第一步中所述用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎至1±0.1mm³。

3.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，所述完全培养液由体积分数90％低糖DMEM，体积分数10％的胎牛血清以及100μ/mL青霉素、100μ/mL链霉素配制而成。

4.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，传代培养过程中完全培养液和抗凋亡保护剂的体积比为100:1-2。

5.根据权利要求1所述的治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，其特征在于，抗凋亡保护剂由以下步骤制成：

将地黄低聚糖和体积分数10％的胎牛血清IMDM培养基混合，配制成浓度400mg/L的培养基。