[发明专利]具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途

说明书

本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸及其在生产目标化合物中的用途，具体来说，本公开涉及具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。本公开提供的具有启动子活性的多核苷酸是一种高盐、高渗透压诱导型的启动子，在盐浓度、渗透压升高的环境下具有增强的启动子活性。多核苷酸与目标基因可操作地连接，可以显著提高目标基因在高盐、高渗透压的胁迫环境下的表达强度，进而稳定、高效的生产下游产物，有效解决了当前添加IPTG等高昂诱导剂、且对菌株造成毒性的问题。

技术领域

本公开属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种具有启动子活性的多核苷酸，包含具有启动子活性的多核苷酸的转录表达盒、重组表达载体、重组宿主细胞，以及调控目标基因转录的方法、制备蛋白的方法和生产目标化合物的方法。

背景技术

棒状杆菌，尤其是非致病的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，由于具有较强的氨基酸合成能力，是美国FDA认定的食品安全菌株，是目前发酵工业中最常使用的菌种之一，广泛用于蛋白、氨基酸、有机酸等化学品的工业化生产。目标基因的表达调控和优化是提高蛋白或产物合成的关键，而启动子元件则是调控基因表达的重要工具。目前，谷氨酸棒状杆菌中已经鉴定或开发了一系列的强启动子^[1-2]或组成型启动子^[3]，用于调控代谢途径中关键基因的表达。尽管上述启动子元件可以精细调控目标基因的表达，然而，对于一些毒性蛋白或代谢产物的合成，组成型启动子的使用还存在较大的限制。此外，强启动子或组成型启动子的表达往往对工程菌株也会造成较大的代谢负担。

诱导型启动子可以控制转录起始的时间，因此更有利于菌株的代谢流调控和重新分配。目前tac、trc等诱导型启动子在谷氨酸棒状杆菌的代谢调控中被广泛使用。然而上述启动子往往需要额外添加昂贵的诱导剂，例如IPTG，这些诱导剂的添加也会对菌株造成一定的毒性，或对发酵体系造成较大的干扰。因此开发工业发酵条件下的自诱导系统对于工业菌株的构建至关重要。现阶段，已有研究报道了部分谷氨酸棒状杆菌中的自诱导启动子，例如赖氨酸诱导型启动子^[4]、生长过程调控型启动子^[5-6]等。但上述自诱导启动子的数量还相对较少，响应的条件也相对较窄，无法在更多的发酵体系和产物合成中普及应用。

在发酵罐中pH和溶氧严格控制的条件下，利用谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸、赖氨酸等大宗化学品的产量能够达到100g/L甚至200g/L以上的水平^[7-8]，因此，在发酵后期高浓度产物或中间代谢物的积累以及底物的不断流加势必引发高盐、高渗的压力。同时，高盐高渗条件也几乎是所有工业菌株在发酵后期都将面临的环境诱导因素^[9]，目前，在谷氨酸棒状杆菌中，尚无高盐高渗诱导型启动子调控目标基因表达的应用先例。

因此，鉴定高盐高渗诱导型启动子，开发构建针对发酵后期高盐高渗条件的自诱导系统，不仅可以增加可用的自诱导系统，而且可以为所有工业菌株的开发提供通用的自诱导元件，这也成为当前谷氨酸棒状杆菌工业菌株开发亟需解决的关键问题。

引用文献：

[1]CN101605890A.

[2]Becker,J.,et al.,Metab.Eng.,2011,13,159-168.

[3]Rytter,J.V.,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2014,98,2617-2623.

[4]CN101087881A.

[5]Kim,M.J.,et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2016,100,4473-4483.

[6]Ma,Y.C.,et al.,Microb.Cell Fact.,2018,17.